棗種質(zhì)資源果實(shí)cAMP和cGMP含量分析

薛曉芳,趙愛(ài)玲,任海燕,王永康,弓桂花,李登科

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)果樹(shù)研究所果樹(shù)種質(zhì)創(chuàng)制 和利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西太原 030031)

棗(ZiziphusjujubaMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZiziphusMill.)植物,原產(chǎn)我國(guó),栽培歷史悠久,種質(zhì)資源豐富,迄今已發(fā)現(xiàn)和記載的棗樹(shù)品種和優(yōu)良類(lèi)型近1000個(gè)[1-2]。棗果實(shí)營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值極高,除含有糖、酸、氨基酸、礦物質(zhì)等一般營(yíng)養(yǎng)成分外[3-6],還含有多糖、類(lèi)黃酮、三萜酸、生物堿、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)、皂苷等多種生物活性成分[7-10],是傳統(tǒng)的滋補(bǔ)佳品。cAMP和cGMP統(tǒng)稱(chēng)環(huán)核苷酸,是核苷酸的衍生物,具有第二信使的作用,參與廣泛的生理生化過(guò)程的調(diào)節(jié)[11-12]。研究表明,cAMP和cGMP通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)參與抗過(guò)敏、提高免疫力、保肝護(hù)肝、抑制心血管疾病和癌癥等多種疾病的代謝過(guò)程[13-17]。

cAMP和cGMP是棗中極具特色的生物活性物質(zhì),自1980年Cyong等[18]首次在大棗中發(fā)現(xiàn)cAMP以來(lái),許多學(xué)者相繼開(kāi)展了棗樹(shù)不同組織部位、不同發(fā)育時(shí)期和不同品種間cAMP和cGMP含量的相關(guān)研究[19-24],結(jié)果表明,葉片、吊梗和果實(shí)三個(gè)部位相比,果實(shí)中含量最高;不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)而言,全紅期含量最高;不同種質(zhì)資源間含量差異較大[25-26]。孫忠親[27]和Fleming等[28]發(fā)現(xiàn)大棗的cAMP在180種中藥原料中含量最高。劉孟軍等[29]研究了棗、酸棗、蘋(píng)果、葡萄等14種園藝植物中cAMP含量,發(fā)現(xiàn)其在棗和酸棗成熟果肉中含量最高。綜上可知,棗果實(shí)富含cAMP和cGMP。然而,前人的研究?jī)H選擇少數(shù)幾個(gè)品種對(duì)其開(kāi)展研究。系統(tǒng)開(kāi)展棗種質(zhì)資源cAMP和cGMP含量評(píng)價(jià),篩選cAMP和cGMP含量較高的種質(zhì)資源,將為cAMP和cGMP功能產(chǎn)品研發(fā)時(shí)選擇原料提供參考。本研究首次從國(guó)家棗種質(zhì)資源圃選擇204份棗種質(zhì)資源,以各資源脆熟期果實(shí)為試材,利用超高效液相色譜法(Ultra-high Performance liquid chromatography,UPLC)分析cAMP和cGMP含量,闡明棗種質(zhì)資源cAMP和cGMP含量特征,通過(guò)聚類(lèi)分析初步篩選含量較高的資源,為cAMP和cGMP功能食品和藥物開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)原料,為棗cAMP和cGMP的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料 取自國(guó)家棗種質(zhì)資源圃,選擇204份代表性棗種質(zhì)資源脆熟期果實(shí)為試材(表1),采樣樹(shù)栽培條件和管理水平一致,每份種質(zhì)選擇9株樹(shù),每三株樹(shù)作為1次生物學(xué)重復(fù),生物學(xué)重復(fù)三次,按照棗種質(zhì)資源成熟期描述規(guī)范[30]采集脆熟期果實(shí)樣品,每份種質(zhì)每個(gè)重復(fù)采集樹(shù)冠外圍大小和成熟度一致、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)30個(gè),置于低溫冰盒中,帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理;cAMP、cGMP 標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;甲醇、乙腈、磷酸 色譜純,德國(guó)默克(Merck)公司;磷酸二氫鉀 優(yōu)級(jí)純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

Acquity UPLC H-class超高效液相色譜儀 美國(guó)沃特世(Waters)公司;Acquity UPLC紫外檢測(cè)器 美國(guó)沃特世(Waters)公司;水浴鍋ZX-S24型 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;3-18K型離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 果實(shí)樣品用不銹鋼刀片迅速切片、去核、混勻,液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩悠诽崛〔捎脽崴岱╗19,31]。步驟如下:取20 g棗果實(shí),加入80 mL超純水勻漿,將勻漿放入60 ℃水浴鍋中浸提48 h(期間每隔2 h振搖一次),然后10000 r/min離心10 min,取上清即為待測(cè)樣液,上機(jī)前用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.2.2 測(cè)定方法 cAMP和cGMP含量的測(cè)定采用Waters UPLC法,紫外檢測(cè)器,環(huán)核苷酸分析專(zhuān)用色譜柱(ACQUITY UPLCRROligonucleotide BEH C18Column,1.7 μm,2.1 mm×100 mm),流動(dòng)相A為甲醇,B為0.02 mol/L的磷酸二氫鉀溶液,用磷酸調(diào)pH為2.38,A∶B=4∶96,流速0.25 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,進(jìn)樣量3 μL。用超純水溶解標(biāo)準(zhǔn)品制得1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液,然后分別將母液稀釋10倍、20倍、30倍、40倍、60倍、100倍、200倍后上機(jī)分析,以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中cAMP和cGMP含量,以μg·g-1鮮重計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后,利用SPSS18.0軟件進(jìn)行變異分析、正態(tài)性檢驗(yàn)、頻率分布及相關(guān)性分析,利用R 3.5.3軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC色譜

從UPLC色譜圖(圖1)可看出,在1.2.2色譜條件下,標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及棗果實(shí)cAMP和cGMP提取液色譜圖中目標(biāo)峰分離度和峰形均較好。

2.2 線性關(guān)系

cAMP和cGMP的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見(jiàn)表1。可看出,在線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999,說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和濃度之間的線性關(guān)系較好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程Table 1 Linear equations for standards

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatogramFigure of standards and sample

2.3 204份棗種質(zhì)資源cAMP和cGMP含量分析

將204份棗種質(zhì)資源cAMP和cGMP含量按照cAMP含量從高到低的順序排列并編號(hào)得到表2,結(jié)合對(duì)cAMP和cGMP含量的變異情況分析(表3),可看出,cAMP含量的范圍在8.06～181.78 μg·g-1·FW,均值為58.01 μg·g-1·FW,變異系數(shù)為53.77%,高于平均含量和低于平均含量的種質(zhì)分別有83份和121份,含量最高的種質(zhì)溆浦香棗cAMP為含量最低種質(zhì)灌陽(yáng)長(zhǎng)棗的22.55倍;cGMP含量的范圍在0.39～76.74 μg·g-1·FW,均值為22.82 μg·g-1·FW,變異系數(shù)為58.81%,高于平均含量和低于平均含量的種質(zhì)分別有95份和109份,含量最高的種質(zhì)溆浦香棗cGMP含量為含量最低種質(zhì)延川狗頭棗的196.77倍。同一種質(zhì)cAMP和cGMP相比,除嵊縣白蒲棗cGMP含量高于cAMP外,其余203份種質(zhì)都是cAMP含量高于cGMP。這與前人的研究結(jié)果一致[19]。一般而言,變異系數(shù)高于10%即表示樣本間差異較大[32],本研究中204份棗種質(zhì)果實(shí)cAMP和cGMP含量的變異系數(shù)都高于50%,說(shuō)明供試種質(zhì)資源間cAMP和cGMP含量差異較大。因此,進(jìn)行種質(zhì)間cAMP和cGMP含量分析,進(jìn)而篩選含量較高的優(yōu)特異種質(zhì)資源具有重要意義。

表2 204份棗種質(zhì)資源脆熟期果實(shí)cAMP和cGMP含量(μg·g-1·FW)Table 2 The cAMP and cGMP contents of crisp ripening fruit for 204 jujube germplasm resources

續(xù)表

續(xù)表

表3 204份棗種質(zhì)資源cAMP和cGMP含量變異情況Table3 The variation of cAMP and cGMP contents in 204 Chinese jujube germplasm resources

2.4 204份棗種質(zhì)資源cAMP和cGMP含量的分布情況

利用SPSS 18.0軟件對(duì)204份棗種質(zhì)資源果實(shí)cAMP和cGMP含量分別進(jìn)行K-S正態(tài)分布檢驗(yàn),結(jié)果表明,cAMP和cGMP含量的K-S值分別為1.324和1.316,Sig.值分別為0.060和0.063,二者的Sig.值均大于0.05,認(rèn)為204份棗種質(zhì)果實(shí)cAMP和cGMP含量均服從正態(tài)分布。從頻率分布直方圖(圖2)可看出,二者的頻率分布圖和正態(tài)曲線具有相似趨勢(shì),cAMP和cGMP都是中低含量種質(zhì)資源所占比例較大,頻率最大的含量范圍都位于正態(tài)曲線峰值左側(cè),如cAMP在41.67～50.00 μg·g-1·FW范圍內(nèi)的種質(zhì)最多,占供試種質(zhì)的14.22%(29份);cGMP在8.00～12.00 μg·g-1·FW范圍內(nèi)的種質(zhì)最多,占供試種質(zhì)的16.67%(34份)。二者都是含量較高的種質(zhì)資源較少,即頻率分布直方圖橫軸右側(cè)含量的資源頻率較小,例如,cAMP含量大于100 μg·g-1·FW的種質(zhì)資源有20份,cGMP含量大于40 μg·g-1·FW的有19份,分別占供試種質(zhì)的9.80%和9.31%。

圖2 不同棗種質(zhì)果實(shí)cAMP和cGMP含量分布圖Fig.2 Distribution plot of the cAMP and cGMP contents in different Chinese jujube germplasm

2.5 cAMP和cGMP含量的相關(guān)性分析

對(duì)204份棗種質(zhì)資源脆熟期果實(shí)cAMP和cGMP含量進(jìn)行相關(guān)性分析(表4),結(jié)果表明,cAMP含量和cGMP含量呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.941。推測(cè)二者在代謝過(guò)程中相互影響,其代謝過(guò)程及二者的影響機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

表4 204份棗種質(zhì)資源cAMP和cGMP含量的相關(guān)性分析Table 4 The correlation analysis among cAMP and cGMP contents in 204 Chinese jujube germplasm resources

2.6 聚類(lèi)分析

圖3 204份棗種質(zhì)資源聚類(lèi)圖Fig.3 Cluster analysis in 204 Chinese jujube germplasm resources map

以cAMP和cGMP含量為基礎(chǔ),利用R語(yǔ)言軟件將204份棗種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析,在遺傳距離為4.5處將供試種質(zhì)資源分為三大類(lèi)群(圖3),同時(shí)統(tǒng)計(jì)每個(gè)類(lèi)群包含的資源并計(jì)算各類(lèi)群的cAMP和cGMP含量平均數(shù)(表5)。

第Ⅰ類(lèi)群包含28份種質(zhì),為cAMP和cGMP含量都較高的資源,分別為:溆浦香棗、臨澤大棗、臨猗笨棗、根德大棗、延川跌牙棗、吳縣水團(tuán)棗、稷山圓棗、梅花小鈴棗、永城圓紅棗、伏脆蜜、大荔干尾巴、南京鴨棗、定襄星星棗、豬腰棗、運(yùn)城婆婆棗、新鄭齊頭白、泰安疙瘩棗、太谷壺瓶棗、六月鮮、新鄭小圓棗、太谷黑葉棗、連縣苦楝棗、南谷豐葫蘆棗、壺瓶酸、溆浦圓棗、衡陽(yáng)珍珠棗、義縣木棗、蘭考圓脆棗,將其定義為高含量類(lèi)群,該類(lèi)群包含的種質(zhì)最少;第Ⅱ類(lèi)群包含71份種質(zhì),為cAMP和cGMP含量都中等的資源,將其定義為中等含量類(lèi)群;第Ⅲ類(lèi)群包含105份種質(zhì),為cAMP和cGMP含量都較低的資源,將其定義為低含量類(lèi)群,該類(lèi)群包含的種質(zhì)最多,占供試種質(zhì)的半數(shù)以上(51.47%)。因此,在提取、純化或開(kāi)發(fā)cAMP和cGMP醫(yī)療保健功能產(chǎn)品時(shí)可選擇其含量較高的種質(zhì)資源加以利用。

表5 不同類(lèi)群包含的種質(zhì)數(shù)及 cAMP和cGMP含量平均數(shù)Table 5 The average contents of cAMP and cGMP and contained germplasms in different clusters

3 結(jié)論

本研究采用UPLC法測(cè)定并分析了204份棗種質(zhì)資源脆熟期果實(shí)中cAMP和cGMP含量,發(fā)現(xiàn)同一種質(zhì)資源都是cAMP含量大于cGMP,不同種質(zhì)資源間二者含量差異都較大,204份種質(zhì)的cAMP和cGMP含量間呈極顯著正相關(guān)。通過(guò)聚類(lèi)分析將供試種質(zhì)分為三大類(lèi)群,共篩選出含量較高的棗種質(zhì)資源28份。其中第Ⅰ類(lèi)群主要是二者含量都較高的種質(zhì),可以在功能性產(chǎn)品研發(fā)或cAMP和cGMP提取純化時(shí)優(yōu)先選擇這些種質(zhì)作為原料。第Ⅱ類(lèi)群和第Ⅲ類(lèi)群分別為含量中等和低含量種質(zhì),可采用分子生物學(xué)手段進(jìn)一步研究不同類(lèi)群種質(zhì)含量差異的機(jī)理,挖掘控制cAMP和cGMP合成的關(guān)鍵基因并闡明其代謝調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而創(chuàng)制含量較高的新種質(zhì)。