黃秋葵多糖緩凍協同微波提取工藝優化及其降血糖作用

張艷軍,李 靖,張玉領,韓永紅

(江蘇護理職業學院藥學與中藥學院,江蘇淮安 223005)

黃秋葵[Abelmosehuseseulentuss(L.)Moeneh]又名Okra、秋葵、補腎草等,是原產于非洲熱帶地區的錦葵科秋葵屬草本植物,現在我國南北方各地均有栽培。黃秋葵的幼嫩莢果是百姓餐桌上常見的保健蔬菜,《本草綱目》記載,黃秋葵的根、莖、花、果實、種子等均可入藥,其根利水消腫,治肺熱咳嗽;種子補脾健胃,治消化不良;全株清熱解毒,潤燥滑腸等[1]。黃秋葵果實含有豐富的蛋白質、游離氨基酸、礦物質及由果膠和多糖等組成的黏性物質,具有降血糖[2]、降血脂[3]、抗疲勞[4]、抗氧化等保健作用。黃秋葵中多糖成分含量約占2%[5]。

植物多糖是普遍存在于天然植物中的聚糖,具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、抗菌抗病毒、保護肝臟等保健作用[6]。植物多糖的提取方法主要有熱水浸提法、酸堿浸提法、酶解提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法等[7]。熱水浸提法耗時長,得率低;酸堿浸提法對酸堿的要求較高;酶解提取法存在酶殘留及降解產物;超聲提取法長時間超聲破壞多糖結構;微波提取法不適用于熱不穩定化合物。緩凍技術是在低溫環境下,細胞中的水分經過長時間冷凍之后凝結成冰晶,刺破細胞壁,有利于多糖的溶出。在解凍過程中,采用微波迅速升溫,微波穿透力強,透過細胞壁使細胞內部產生高溫高壓,沖破細胞膜和細胞壁,細胞內容物質更快更徹底地流出[8]。因此緩凍協同微波方法能夠克服微波不適用對熱不穩定化合物的缺點,同時提高得率。向東等比較了緩凍和超聲波兩種方法強化南瓜多糖的提取,結果表明緩凍方法提取效果明顯優于超聲波方法[9]。李超柱等采用了緩凍協同微波的方法對甘薯多糖進行提取,顯著提高了多糖的得率[10]。

2型糖尿病是由胰島素調控葡萄糖代謝能力下降(胰島素抵抗)伴隨胰島β細胞功能缺陷所導致的胰島素分泌減少(或相對減少)為病理生理學特征的代謝性疾病[11]。2型糖尿病患者餐后高血糖(PPHG)比空腹高血糖更易導致微血管和大血管并發癥[12],有效的降低餐后血糖,對PPHG進行有效的管理被科學界認為是2型糖尿病治療的主要策略之一[13]。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制小腸內低聚糖分解成葡糖糖,減少葡糖糖吸收進入血液循環而降低PPHG,是臨床常用的一類口服降糖藥物[14-15]。目前已從多種常見植物中分離制備出多糖用于抑制α-葡萄糖苷酶的研究[16]。

本文采取緩凍協同微波輔助提取方法提取黃秋葵多糖,采用響應面優化設計,探索黃秋葵多糖的最優提取工藝。同時通過黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶的活性和對腎上腺素所致高血糖小鼠血糖的影響,探索黃秋葵多糖的降血糖作用,為黃秋葵多糖的生理活性的研究提供補充,促進黃秋葵的市場應用與開發。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明(KM)小鼠 雄性,SPF級,體重19～22 g,許可證號:SCXK(蘇)2016-0002,由南京君科生物科技有限公司提供;黃秋葵果實 江蘇省淮安市景臺農業生態園;對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、α-葡萄糖苷酶 美國Sigma公司;谷胱甘肽 上海藍季科技發展有限公司;阿卡波糖 德國拜耳醫藥保健有限公司;鹽酸腎上腺素注射液 上海禾豐制藥有限公司;鹽酸二甲雙胍片 上海施貴寶制藥有限公司;葡萄糖、苯酚、濃硫酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、乙醇、三氯甲烷、正丁醇、石油醚 國藥集團化學試劑有限公司,均為分析純。

T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;LGJ-18冷凍干燥機 北京松源華興生物技術有限公司;NJL07-3實驗用微波爐 南京杰全微波設備有限公司;DZKW-S-8恒溫水浴箱 蘇州江東精密儀器有限公司;DX-30B小型實驗用粉粹機 廣州市大祥電子機械設備有限公司;TGL-10C離心機 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃秋葵多糖的提取 取黃秋葵果實,純化水清洗干凈,冷凍干燥,粉粹過篩(60目),3倍體積石油醚脫脂,揮干溶劑,黃秋葵粉與去離子水按照一定液料比混合,在一定溫度下水浴浸提一定的時間,然后在-20 ℃環境下冷凍一定時間,在一定功率下微波處理,提取液加入等體積Sevage試劑(三氯甲烷/正丁醇4∶1),充分振搖后靜置,4000 r/min離心10 min,取上清液,加入3倍體積95%乙醇溶液,4 ℃沉淀過夜,4000 r/min離心10 min,沉淀物依次用70%乙醇溶液、95%乙醇溶液、無水乙醇洗滌,然后用去離子水溶解,測定吸光度。

1.2.2 單因素實驗 以黃秋葵多糖得率為評價指標,選取緩凍時間、液料比、浸提時間、浸提溫度、微波功率5個因素做單因素試驗,考察各因素對黃秋葵多糖得率的影響。固定液料比40∶1 (mL/g),浸提溫度60 ℃,浸提時間2 h,微波功率300 W,探究不同緩凍時間(8、12、16、20、24 h)對黃秋葵多糖得率的影響;固定緩凍時間16 h,浸提溫度60 ℃,浸提時間2 h,微波功率300 W,探究不同液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g)對黃秋葵多糖得率的影響;固定緩凍時間16 h,液料比40∶1 (mL/g),浸提溫度60 ℃,微波功率300 W,探究不同浸提時間(1、1.5、2、2.5、3 h)對黃秋葵多糖得率的影響;固定緩凍時間16 h,液料比40∶1 (mL/g),浸提時間2 h,微波功率300 W,探究不同浸提溫度(40、50、60、70、80 ℃)對黃秋葵多糖得率的影響;固定緩凍時間16 h,液料比40∶1 (mL/g),浸提溫度60 ℃,浸提時間2 h,探究不同微波功率(100、200、300、400、500 W)對黃秋葵多糖得率的影響。

1.2.3 響應面試驗優化提取工藝 在單因素實驗的基礎上,按照Box-behnken Design試驗設計原理,選擇液料比A、浸提時間B、浸提溫度C、微波功率D等4個因素作為考察因素,以黃秋葵多糖得率為響應值,采用四因素三水平響應面分析法進行試驗設計。試驗設計因素與水平編碼表見表1。

表1 Box-behnken Design試驗設計因素水平編碼表Table 1 CodeTable of factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4 黃秋葵多糖含量的測定

1.2.4.1 葡萄糖溶液標準曲線的繪制 準確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.0250 g置于250 mL容量瓶,加純化水定容至刻度,搖勻,即得濃度為100.00 μg/mL的標準葡萄糖溶液。移取上述標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于10 mL容量瓶中,分別依次加入6%苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,搖勻,靜置5 min,用純化水定容至刻度,充分搖勻,沸水浴放置30 min,冷卻,于490 nm波長處測定吸光度值,以葡萄糖質量濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線,得到回歸方程:y=0.0681x+0.0095,R2=0.9994。

1.2.4.2 黃秋葵多糖的得率測定 取1 mL黃秋葵多糖提取液于100 mL容量瓶中,用純化水定容至刻度,準確量取1 mL于10 mL容量瓶中,分別依次加入6%苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,靜置5 min,用純化水定容至刻度,搖勻后沸水浴放置30 min,冷卻,于490 nm波長處測定吸光度。根據回歸方程測定多糖的含量。然后根據以下公式計算多糖的得率。

式中:m1:測定的多糖的質量(g),V:多糖提取液的體積(mL),n:多糖提取液的稀釋倍數,m:黃秋葵果實粉末質量(g)

1.2.5 黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響 反應體系為67 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(37 ℃,pH6.8)860 μL,1 mg·mL-1谷胱甘肽溶液25 μL,2.74 U·mL-1α-葡萄糖苷酶溶液35 μL,與黃秋葵多糖(2,6,10 mg·mL-1)10 μL,阿卡波糖(2、6、10 mg·mL-1)10 μL;混勻,37 ℃恒溫10 min,加入15 mmol·L-1pNPG溶液60 μL,繼續恒溫10 min,加入0.1 mol·L-1碳酸鈉溶液4 mL,于波長400 nm處測定吸光度(A)。α-葡萄糖苷酶管不加多糖,樣品空白管除不加pNPG外其余同樣品管,空白管不加pNPG,其余用等體積的純化水補充[17]。

式中A酶:α-葡萄糖苷酶管的吸光度;A樣:多糖樣品管的吸光度;A樣空:樣品空白管的吸光度;A空:空白管的吸光度

1.2.6 黃秋葵多糖對腎上腺素所致高血糖小鼠血糖水平的影響 取昆明小鼠60只,隨機分成6組,對照組按250 mg/kg bw每日一次灌胃二甲雙胍;實驗組按照低劑量組100 mg/kg bw、中劑量組200 mg/kg bw、高劑量組400 mg/kg bw每日一次灌胃黃秋葵多糖。同時設空白對照組和腎上腺素處理組,每日一次灌胃等體積生理鹽水。此外除空白對照組外,其余各組按0.2 mg/kg bw每日一次腹腔注射腎上腺素,空白對照組注射生理鹽水,連續注射7 d。最后一次給藥前禁食12 h,給藥后30 min眼眶采血,血糖儀測定空腹血糖(FBG)[18]。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 黃秋葵多糖提取工藝單因素實驗結果

2.1.1 緩凍時間對黃秋葵多糖得率的影響 不同緩凍時間對黃秋葵多糖得率的影響結果如圖1所示。在緩凍8～16 h范圍內,隨著緩凍時間的延長,黃秋葵多糖的得率不斷增加,緩凍16 h后得率增加不顯著(P>0.05)。黃秋葵在冷凍狀態下細胞內產生冰晶破壞細胞壁,多糖釋放細胞壁的阻礙相應減少,有利于細胞內多糖的溶出。但凍結時間過長,分子的熱運動長時間處于抑制狀態又不利于細胞內多糖的溶出[19],因此選擇16 h作為最佳緩凍時間。

圖1 緩凍時間對黃秋葵多糖得率的影響Fig.1 Effect of slowfreezing time on the extraction rate of okra polysaccharides

圖2 液料比對黃秋葵多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solidratio on the extraction rate of okra polysaccharides

2.1.2 液料比對黃秋葵多糖得率的影響 不同液料比對黃秋葵多糖得率的影響結果如圖2所示。隨著液料比的增加,多糖得率出現先升高后降低的趨勢,在液料比為40∶1 (mL/g)時,黃秋葵多糖得率出現最大值,且與其它比例存在顯著性差異(P<0.05)。隨著溶劑的增多,黃秋葵細胞內與溶劑間的多糖濃度梯度也相應增加,使得多糖的溶出更加容易,但當液料比超過40∶1 (mL/g)時,再繼續增大容積的量,同樣促進細胞內其他物質溶出[20],與多糖溶出相競爭,抑制多糖的溶出。因此確定最佳液料比為40∶1 (mL/g),選擇液料比30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g)進行響應面優化試驗。

2.1.3 浸提時間對黃秋葵多糖得率的影響 不同浸提時間對黃秋葵多糖得率的影響結果如圖3所示。在浸提時間1～2 h范圍內,黃秋葵多糖的得率增加顯著,2 h時出現最大值,繼續延長浸提時間,多糖得率無顯著變化。在提取初期,由于溶劑內多糖的濃度較小,黃秋葵細胞內外多糖的濃度梯度較大,因此多糖滲透、溶解、擴散的速度顯著增加,多糖的得率增加趨勢顯著。但浸提是在一定溫度的水浴中進行,隨著浸提時間增加,多糖容易發生降解,進而影響了多糖得率[21]。因此確定最佳浸提時間為2 h,選擇浸提時間1.5、2、2.5 h進行響應面優化試驗。

圖3 浸提時間對黃秋葵多糖得率的影響Fig.3 Effect of extracting time on the extraction rate of okra polysaccharides

2.1.4 浸提溫度對黃秋葵多糖得率的影響 不同浸提溫度對黃秋葵多糖得率的影響結果如圖4所示。在40～80 ℃溫度范圍內,隨著溫度的增加,多糖得率呈現先增加后減少的趨勢,在60 ℃多糖得率最高,且差異顯著(P<0.05)。浸提溫度的升高,加快多糖分子熱運動,同時降低浸提液粘度,從而增加多糖擴散系數,有利于多糖的溶出,但浸提溫度超過60 ℃后,繼續增加溫度,多糖的結構被破壞,導致多糖得率降低[22]。因此確定最佳浸提溫度為60 ℃,選擇液料比50、60、70 ℃進行響應面優化試驗。

圖4 浸提溫度對黃秋葵多糖得率的影響Fig.4 Effect of extracting temperature on the extraction rate of okra polysaccharides

2.1.5 微波功率對黃秋葵多糖得率的影響 微波功率對黃秋葵多糖得率的影響結果如圖5所示。多糖的得率隨著微波功率的增加而不斷增加,在300 W時出現最大值。由于微波強的穿透能力,使細胞內溫度迅速升高,致使液態水快速汽化,從而產生強大的壓力,沖破細胞膜和細胞壁,促進多糖溶出[23]。但功率超過300 W后,多糖的結構遭到破壞,導致多糖得率略有下降。因此確定最佳微波功率300 W,選擇微波功率200、300、400 W進行響應面優化試驗。

圖5 微波功率對黃秋葵多糖得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the extraction rate of okra polysaccharides

2.2 響應面優化設計和分析結果

2.2.1 響應面優化試驗設計及結果 根據單因素實驗結果,應用Design-Expert.V8.0.6軟件,以液料比A、浸提時間B、浸提溫度C、微波功率D為試驗因素,進行了四因素三水平共29個響應面分析試驗,試驗設計方案與結果見表2。

表2 Box-Behnken 設計方案與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 回歸模型有效性和顯著性分析 采用Design-Expert.V8.0.6程序軟件對表2試驗結果進行響應面分析,得到黃秋葵多糖得率Y與液料比(A)、浸提時間(B)、浸提溫度(C)、微波功率(D)四因素回歸擬合方程Y=16.66+0.16A+1.11B+1.35C+0.54D-0.05AB+0.023AC-0.06AD+0.42BC-0.25BD-0.11CD-1.09A2-1.69B2-1.87C2-1.97D2對回歸方程進行方差分析,結果見表3。

2.2.3 響應曲面結果分析 以任意兩個因素為考察對象,其他因素選取響應面設計中0水平對應的值,利用Design-Expert.V 8.0.6繪制兩因素之間交互作用的等高線圖和3D響應曲面圖,見圖6。響應面坡度的陡峭程度直觀地反映了各因素對響應值的影響,響應面坡度陡峭,說明因素對響應值的影響較大,反之,響應面坡度平緩,說明因素對響應值的影響教小[24]。在響應面等高線圖中,曲線離中心越近,對應的響應值也越大。此外,等高線的形狀可直觀反映出自變量之間交互效應的顯著性,等高線形狀若呈圓形,表明兩個自變量間的交互效應不顯著,若等高線的形狀呈橢圓形,則表明兩個自變量間有顯著的交互作用[25]。BC等高線為橢圓形,說明浸提溫度和浸提時間兩因素的交互作用顯著,對響應值的影響較大,浸提時間與液料比、浸提溫度與液料比、微波功率與液料比、微波功率與浸提時間、微波功率與浸提溫度等高線圖接近圓形,交互作用不顯著,對響應值的影響較小。此外從響應曲面可以看出,浸提時間、浸提溫度、微波功率對黃秋葵多糖得率的影響大于液料比,浸提溫度對大于浸提時間,浸提時間大于微波功率,這與回歸模型的顯著性分析一致。

圖6 兩因素交互作用的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the interaction of two factors

2.2.4 響應優化提取條件及驗證試驗 利用Design-Expert.V 8.0.6軟件對各因素進行優化,對回歸方程進行求解,獲得預測的黃秋葵多糖得率最優的工藝條件是液料比:40.7∶1 (mL/g);浸提時間2.19 h;浸提溫度64 ℃;微波功率310 W,在此條件下,黃秋葵多糖的得率最優值是17.17%。結合實際情況,將優化工藝條件修正為液料比40∶1 (mL/g);浸提時間2.2 h;浸提溫度65 ℃;微波功率310 W,并以此為條件對實驗模型進行試驗驗證,得到黃秋葵多糖得率為17.10%±0.13%,與擬合預測值相差0.07%,說明該優化響應面模型有效,可靠性好。

2.3 黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響

α-葡萄糖苷酶抑制劑的降糖機制是通過抑制小腸黏膜上的α-葡萄糖苷酶的活性,降低寡糖的分解速率,使碳水化合物的消化過程向小腸底部延伸,從而延遲葡萄糖進入血液,降低葡萄糖的總吸收率而降低血糖,對餐后高血糖的作用比較明顯,是降低餐后血糖升高的最佳策略之一,并且有助于避免晚期糖尿病并發癥的發生[26]。葡萄糖苷酶抑制劑不刺激胰島素的分泌,單獨使用本類藥物通常不會引發低血糖,因此有助于減少血糖的波動。目前臨床常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖、伏格列多糖等,阿卡波糖是從放線菌的次生代謝產物分離出來的α-葡萄糖苷酶抑制劑,對控制餐后血糖的升高有顯著療效,是臨床餐后高血糖患者的首選藥物[27]。由表4可以看出黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用,且具有劑量依賴性,隨著濃度的增加抑制率明顯增強。但同等質量濃度下,黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率要低于阿卡波糖,且差異顯著(P<0.01),可能是由于黃秋葵多糖成分復雜,從而在同等質量濃度下影響了抑制率。試驗結果表明,黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性,可開發為具有降糖功效的膳食補充劑或保健食品,也可通過進一步研究開發成為新的降糖藥物。

表4 黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Table 4 Inhibitory effect of okra polysaccharide on α-glucosidase

2.4 黃秋葵多糖對腎上腺素引起高血糖小鼠血糖水平的影響

腎上腺素是腎上腺髓質分泌的一種遞質,通過與肝和肌肉細胞膜受體結合,促使肝糖元分解,同時能夠抑制胰島素的釋放,減少外周組織對葡萄糖的攝取,從而升高血糖[28]。由表5可以看出,連續灌胃7 d后,腎上腺素組小鼠的血糖值為12.67 mmol/L,二甲雙胍對照組和黃秋葵多糖各組小鼠血糖值均明顯低于腎上腺素組(P<0.01),說明黃秋葵多糖對腎上腺素引起的高血糖小鼠的血糖水平有明顯的抑制作用。二甲雙胍灌胃7 d后血糖值為7.69 mmol/L,黃秋葵多糖低、中劑量組小鼠血糖值分別為9.75和8.78 mmol/L,高于二甲雙胍組,且存在極顯著差異(P<0.01),多糖高劑量組血糖值為8.41 mmol/L,與二甲雙胍組比較差異顯著(P<0.05),說明黃秋葵多糖對腎上腺素引起的高血糖小鼠血糖水平的抑制作用要弱于二甲雙胍。以上結果表明黃秋葵多糖對腎上腺素引起的高血糖小鼠的血糖水平有明顯的抑制作用,且高劑量組抑制作用比較明顯,說明黃秋葵多糖具有明顯的降低血糖的作用。

表5 黃秋葵多糖對腎上腺素 引起高血糖小鼠血糖水平的影響Table 5 Effects of okra polysaccharide on blood glucose in adrenaline-induced hyperglycemic mice

3 結論

本實驗采取緩凍協同微波提取的方法,通過單因素試驗考查不同因素對黃秋葵多糖得率的影響,確定合適的提取條件,通過響應面實驗設計優化黃秋葵多糖的提取工藝,得出黃秋葵多糖的最佳提取工藝條件是緩凍時間16 h,液料比40∶1 (mL/g),浸提時間2.2 h;浸提溫度65 ℃,微波功率310 W,在此條件下,黃秋葵多糖的得率可達到17.17%,且黃秋葵多糖得率的影響因素依次是浸提溫度>浸提時間>微波功率>液料比。黃秋葵多糖能明顯降低腎上腺素引起高血糖小鼠血糖水平,通過抑制α-葡萄糖苷酶,延緩碳水化合物的吸收,使血糖不會集中在小腸的上端吸收而使血糖急劇增加,改善餐后血糖的高峰,降低糖尿病患者餐后血糖,同時有助于降低晚期糖尿病患者的并發癥。黃秋葵多糖其它方面的降血糖機制還有待進一步研究。