超聲輔助檸檬酸提取百香果果皮高酯果膠及其理化性質分析

辛 明,李昌寶,*,李杰民,黃音如,孫 宇,唐雅園,盛金鳳, 孫 健,*,李 麗,鄧 軍,何雪梅,劉國明,零東寧

(1.廣西壯族自治區農業科學院農產品加工研究所,廣西南寧 530007; 2.廣西果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室,廣西南寧 530007; 3.南寧云鷗物流股份有限公司,廣西南寧 530007)

百香果為西番蓮科(PassifloracaeruleaL.)西番蓮屬(Passiflora)多年生常綠藤本植物,屬于熱帶亞熱帶水果[1-2]。主要分布在我國廣西、福建、海南、廣東、云南、臺灣等地[3],其中,廣西、福建百香果產業發展較快,2017年兩省栽培面積分別達14000、6700 hm2[4-5]。百香果富含果膠、多糖、多酚、黃酮、生物堿、維生素、人體必需氨基酸以及礦物質等多種有益成份,具有護膚養顏、生津止渴、安神抗焦慮、抗炎抑菌、防癌抗衰等多種醫藥保健功效[6-9]。據研究報道,百香果果皮占鮮果的50%～55%,在百香果加工過程中往往造成巨大的浪費,還會嚴重污染環境,因此百香果果皮高值化利用迫在眉睫[10]。

百香果果皮中富含多糖,其果膠含量可占果皮干重的10%以上[11-12]。從廢棄果皮中提取果膠,可提高百香果的附加值,能為加工企業創造可觀的經濟價值。目前百香果果皮果膠的提取已成為了國內外的研究熱點,常用的方法有傳統水提、酸提醇沉、酶法提取、微波輔助提取、超聲波輔助提取及超高壓提取等方法[13]。Juliana等[14]優化了黃色百香果果皮果膠酶法的提取工藝,優化得到最佳工藝:溫度37.0 ℃,酶用量30 U/mL,pH3.00,攪拌速度408 r/min,其果膠得率為21.7 g/100 g,酯化度(Degree of esterification,DE)為68%。Oliveira等[15]研究了超聲條件對百香果果皮果膠提取率的影響,結果表明最佳工藝為:超聲功率644 W,超聲溫度85.0 ℃,料液比1∶30 (W∶V),pH2.00,超聲時間10 min,在該條件下果膠得率為12.67%,DE值為60.36%。Seixas等[16]研究了微波輔助提取對百香果果皮果膠提取率的影響,結果表明在萃取功率628 W,萃取時間9 min時,果膠提取率為12.90%～18.20%。Oliveira等[17]采用高壓處理預處理百香果果皮后提取果膠,結果發現果膠得率為7.40%～14.34%,DE值為50%。陳穎珊等[18]采用混合酸(鹽酸、檸檬酸)提取紫色百香果果皮果膠,優化得到最佳工藝條件為:提取溫度65.5 ℃,料液比1∶45 (W∶V),pH1.50,在該條件下果膠得率為10.98%,DE值為63.77%。在果膠工業生產中,因考慮生產成本,往往采用酸法提取。在現有酸法提取研究中多采用鹽酸、硫酸等無機酸提取,所得果膠甲酯化度(DE)果膠較低,而檸檬酸屬于有機弱酸是提取百香果果皮果膠的較佳溶劑,所提取得到的果膠DE值較高,比鹽酸、硫酸等效果好[18]。

針對工業化生產上酸法提取的不足,采用超聲輔助檸檬酸提取百香果果皮果膠,以提高果膠得率及酯化度。目前,超聲輔助檸檬酸提取百香果果皮果膠的研究鮮有報道。本文采用超聲輔助檸檬酸提取百香果果皮果膠,開發完善果膠提取工藝,并對所提取到的果膠進行理化性質分析,以期為百香果果皮果膠的工業化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百香果(PassifloracaeruleaL.) 品種為“臺農1號”,2018年10月采自廣西南寧市邕寧區,選7～8成熟(花后55～60 d)果實,采收后于常溫條件下運回實驗室并當天處理;檸檬酸、咔唑、無水乙醇、酚酞、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;半乳糖醛酸 分析純,Sigma公司。

JY92-ⅡDN型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;FLBP-35OA型萬能高速粉碎機 上海菲力博食品機械有限公司;Genesys 10s UV vis紫外可見分光光度計 Thermo Fisher Scientific;RE-52AA型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;HH-S4數顯恒溫水浴鍋 金壇市萬華實驗儀器廠;BR-12N型馬弗爐 鄭州博納熱窯爐有限公司;PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;3K15高速低溫離心機 Sigma;PILOT10-15M型凍干機 北京博醫康實驗儀器有限公司;太陽能-熱泵干燥設備 自制(自制單位:廣西壯族自治區農業科學院農產品加工研究所、廣西機電職業技術學院,專利號ZL 201320617683.6)。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理 新鮮百香果→清洗干凈→取果皮→切成小塊(2 cm×2 cm)→太陽能-熱泵干燥(55 ℃,6～8 h)→粉碎(2 min)→過80目篩→百香果果皮粉末(備用)。

1.2.2 果膠提取工藝流程 稱取1.0 g粉末,按設定的實驗提取條件,加入一定體積的蒸餾水,用檸檬酸調節pH,在50 ℃水浴條件下進行超聲提取,提取液真空濃縮后加入2倍體積95%乙醇攪拌均勻,沉淀1.5 h,再用95%乙醇洗滌2～3次,進一步除去色素及其它雜質成分,冷凍干燥,即得百香果果皮果膠。

1.2.3 果膠得率 釆用咔唑比色法測定半乳糖醛酸含量[20]。在具塞試管分別準確加入1 mL濃度為0、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL半乳糖醛酸標準溶液,沿試管壁小心加入6 mL濃硫酸,在沸水浴中反應20 min,冰浴冷卻,再分別加入0.5 mL 0.15%咔唑-乙醇溶液,在室溫下暗處放置顯色1.5 h,在528 nm波長處測定吸光值,以0號做參比。以吸光度為縱坐標、半乳糖醛酸濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程為:y=0.0089x-0.003(R2=0.9989)。取果膠樣品用蒸餾水復容后,精密移取一定體積稀釋,準確吸取1 mL經過稀釋的果膠樣液于具塞試管中,用以代替半乳糖醛酸標準液,按照上述咔唑比色法測定吸光值。按下面公式計算百香果果皮果膠得率。

式中,C:由標準曲線計算所得的半乳糖醛酸濃度,μg/mL;V:果膠原液的總體積,mL;N:將果膠原液稀釋的倍數;W:百香果果皮粉末的質量,g。

1.2.4 單因素實驗 設定基礎條件:檸檬酸調整提取液pH為3.00,料液比1∶30 g/mL,超聲溫度60 ℃,提取時間30 min,超聲功率210 W。固定其他條件,分別考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、pH(2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50)、提取時間(30、45、60、75、90、105 min)、超聲功率(150、180、210、240、270、300 W)對百香果果皮果膠得率的影響。各實驗重復3次。

1.2.5 正交試驗設計 在單因素實驗的基礎上,以百香果果皮果膠得率為指標,按L9(34)正交表做正交試驗,各因素水平設計見表1,最終確定超聲輔助檸檬酸提取百香果果皮果膠的最佳工藝。

表1 正交試驗水平因素表Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

1.2.6 指標測定

1.2.6.1 果膠的鑒別 參考石海燕[19]方法,稍有改動:準確稱取1.0 g果膠,加入去離子水40 mL,不斷攪拌,觀察溶液狀態;吸取5 mL樣品溶液,加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液靜置15 min觀察溶液的變化情況,取1 mL處理好的溶液中加入1 mL鹽酸溶液觀察溶液的變化情況,隨后煮沸繼續觀察溶液的變化情況。

1.2.6.2 干燥失重的測定 參考王琨[20]方法,稍有改動:稱取干果膠2.0 g(精確到0.0001 g),放于已恒重的器皿中,在105.0 ℃下恒溫干燥2 h,取出,放于玻璃干燥器中冷卻至常溫,稱量,并重復操作直至恒重。果膠干燥失重X(%)的計算參照下面所列公式:

式中,m:果膠樣品的質量,g;m1:干燥前果膠和器皿的質量,g;m2:干燥后果膠和器皿的質量,g。

1.2.6.3 灰分含量的測定 參考石兵艷等[21]方法,稍有改動:稱取百香果果皮果膠1.0 g(精確到0.0001 g)放到已恒重的瓷坩堝中,加熱灼燒灰化,當瓷坩堝里的果膠不冒煙時,將瓷坩堝轉移到550.0 ℃的馬弗爐中4 h,溫度降到200.0 ℃后取出,置于玻璃干燥器中冷卻至常溫后稱重。果膠灰分X(%)的計算參照下面所列公式:

式中,m:果膠的質量,g;m1:瓷坩堝和果膠灰分的質量,g;m2:瓷坩堝的質量,g。

1.2.6.4 酸不溶物含量的測定 參考石兵艷等[21]方法,稍有改動:將測完灰發含量的樣品轉移至燒杯,緩慢加入鹽酸30 mL,加熱至沸騰5 min后用已恒重的砂芯漏斗過濾直至不含氯離子為止(用0.1 mol/L的AgNO3檢驗)。將砂芯漏斗置于干燥箱中在105.0 ℃條件下干燥至恒重,然后置于玻璃干燥器中冷卻至常溫后稱重。果膠酸不溶物X(%)的計算參照下面所列公式:

式中,m:果膠樣品的質量,g;m1:砂芯漏斗和酸不溶物的質量,g;m2:砂芯漏斗的質量,g。

1.2.6.5 pH的測定 稱取百香果果皮果膠1.2 g,加入50 mL超純水,在40.0 ℃下水浴條件下攪拌至果膠完全溶解,冷卻至室溫后用pH計測定pH。

1.2.6.6 酯化度DE的測定 取0.50 g百香果果皮果膠,用少量乙醇潤濕后加入100 mL蒸餾水,完全溶解后加入酚酞指示劑,用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液呈粉紅色,所消耗的體積記錄為V1(mL);加入20 mL的0.5 mol/L NaOH溶液進行皂化2 h,再用20 mL的0.5 mol/L HCL溶液進行酸化,然后用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至溶液呈粉紅色,所消耗的體積記錄為V2(mL)[22]。百香果果皮果膠的酯化度DE(%)的計算參照下面所列公式:

1.3 數據處理

所有數據為3次以上重復實驗的平均值±標準差,采用Origin 8.1軟件作圖,用SPSS 19.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同料液比對百香果果皮果膠得率的影響

由圖1可知,隨著料液比的增加,百香果果皮果膠得率呈先增加后降低的趨勢,料液比在1∶10～1∶30 (g/mL)階段,果膠得率逐漸上升,從4.49%增加至11.43%;在1∶30 (g/mL)之后,果膠得率逐漸降低。其原因可能是當提取溶液較少時物料粘度過大,使得擴散速度較慢,原料中的果膠難以被大量轉移到提取液中,因此會造成提取不完全、得率低的情況;當原料和提取溶劑之間的濃度差達到1∶30 (g/mL)時,液料體系達到動態平衡,即百香果果皮果膠基本被充分提取,從而達到最大值;1∶30 (g/mL)之后,隨著提取溶劑的增加會相應加大其對超聲能量消耗,從而導致得率下降[23]。考慮到后續的濃縮工作及生產成本問題,料液比選擇以1∶30為宜。

圖1 料液比對果膠得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the extraction rate of pectin

2.2 不同pH對百香果果皮果膠得率的影響

由圖2可知,pH的變化對百香果果皮果膠的提取得率有較大的影響,隨著pH的增加,百香果果皮果膠得率呈逐漸上升后降低的趨勢,pH為2.50時得率最高(13.87%),這是由于果膠是一種酸性多糖,在一定范圍內酸度增大能使原果膠的水解增強,而使原果膠分解為水溶性果膠;但當pH大于2.50時,果膠的得率下降,溶于水溶液中的果膠在強酸性條件下發生脫酯裂解,從而使果膠提取得率下降[24]。因此選擇pH2.50為宜。

圖2 pH對果膠得率的影響Fig.2 Effect of pH value on the extraction rate of pectin

2.3 不同提取時間對百香果果皮果膠得率的影響

由圖3可知,隨著提取時間的增加,百香果果皮果膠得率呈先升高后逐漸降低的趨勢,在提取時間30～75 min時得率從8.33%上升至11.65%;在提取時間75～105 min時得率從11.65%下降至10.57%。這可能是由于提取時間過短,則百香果果皮中的果膠溶出不完全,果膠得率低;而提取時間過長,在熱效應與超聲下,可能會造成部分果膠發生雙重降解,造成果膠得率下降[25]。因此選擇提取時間75 min為宜。

圖3 提取時間對果膠得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of pectin

2.4 不同超聲功率對百香果果皮果膠得率的影響

超聲輔助提取可利用其空化作用、機械效應及機械剪切作用對原料進行破碎,從而使細胞壁穿透性增加,促進細胞內有效成分溶出[26-27]。由圖4可知,百香果果皮果膠得率隨著超聲功率的增加,呈先上升后減小的趨勢,在超聲功率180 W時得率最大(11.83%),這是因為在超聲功率過低時,百香果果皮果膠提取不完全,而當超聲功率過高時,果膠則會發生降解,從而影響果膠得率。因此選擇超聲功率180 W為宜。

圖4 超聲功率對果膠得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of pectin

2.5 正交試驗結果

以百香果果皮果膠得率為考察指標,通過L9(34)正交試驗優化超聲輔助檸檬酸提取百香果果皮果膠工藝條件。正交試驗結果及分析見表2,方差分析見表3。由表2可知,由R值可得出得率影響因素大小依次為C>A>B>D,即:提取時間>料液比>pH>超聲功率。由表3方差分析可知,提取時間、料液比、pH對百香果果皮果膠得率影響顯著,超聲功率影響不顯著。綜上所述,根據正交試驗結果,確認最佳工藝條件為A3B1C1D2,即:料液比1∶40 (g/mL)、pH2.00、提取時間60 min、超聲功率為180 W。

表2 L9(34)正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test design

表4 百香果果皮果膠的理化性質Table 4 Physical and chemical properties of pectin extracted from passion fruit peel

2.6 驗證實驗

按照正交實驗結果篩選出最佳提取條件A3B1C1D2進行驗證,得率平均值為13.07%±0.19%,與正交試驗表中最大值接近。

2.7 果膠的鑒別

1.0 g果膠于40 mL水中,果膠逐漸溶解,形成凝膠狀的黏稠溶液;在果膠溶液中加入氫氧化鈉后,果膠溶液出現凝結的情況,為半透明半凝膠狀的;在凝膠沉淀中加入鹽酸溶液后,果膠凝結部分碎成小塊狀的凝膠,顏色為無色透明狀凝膠,煮沸時則變成成絮狀沉淀。該果膠鑒別試驗過程中的現象符合GB 25533-2010《食品添加劑 果膠》所規定的要求,可證明超聲輔百香果果皮助檸檬酸法提取的物質為果膠。

2.8 果膠的理化性質

百香果果皮果膠的理化性質見表4。采用超聲輔助檸檬酸法提取的百香果果皮果膠的干燥失重、灰分含量、酸不溶物含量等均符合國家標準GB 25533-2010的有關規定。所提取果膠的酯化度為72.32%,屬于高酯化果膠(DE>50%)。姜燕等[28]采用質量分數為10%的鹽酸提取百香果果皮果膠,水分為9.22%、粗灰分為5.93%、pH為3.47、酯化度為67.80%,與本試驗相比,超聲輔助檸檬酸法所得果膠樣品灰分更低、酯化度更高。

3 結論

研究結果表明,在單因素實驗中,料液比、pH、提取時間、超聲功率4個因素隨著因素水平的增加,均呈先上升后下降的趨勢。在正交實驗中,由極差分析結果可知,各因素對百香果果皮果膠得率影響順序為:提取時間>料液比>pH>超聲功率;超聲輔助檸檬酸提取百香果果皮果膠的最佳工藝條件為:料液比1∶40 (g/mL)、pH2.00、提取時間60 min、超聲功率為180 W。該條件下果膠得率為13.07%。該條件下果膠干燥失重為5.92%、灰分含量為4.18%、酸不溶物含量為0.27%、pH為3.55、酯化度為72.32%,屬于高酯化果膠。本研究優化的提取工藝成本低廉、操作簡單、得率高,可為百香果果皮果膠工業化生產提供一種新的途徑。由于時間和實驗條件的限制,對百香果果皮果膠物性的探討還不完善,后續將進一步對果膠進行純化并測定和觀察其分子量、單糖組成、流變模型及內部微觀結構,為百香果果皮果膠功能產品的開發及擴大應用提供理論依據。