溶劑法與超聲輔助法提取黑果枸杞多酚的工藝比較

武 蕓,曾文齊,王麗朋,楊娜娜,胡浩斌

(隴東學院化學化工學院,甘肅慶陽 745000)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科(Solanceae)枸杞屬(LyciumL.)植物,是重要的藥食同源植物[1-2],被收載于《晶珠本草》、《四部醫典》等藏藥著作中,是近年來新發掘的多年生耐鹽、抗旱野生植物資源[3-5]。現代醫學及營養學表明,黑果枸杞具有抗氧化[6-8]、抗動脈粥樣硬化[9]、抗炎[10]、抗疲勞[11-12]、增強腸道屏障功能[13]、防治心腦血管疾病[14]、防痛風性關節炎[15]等功效,被譽為“軟黃金”、“花青素之王”,是現階段枸杞育種和藥效研究領域的熱點之一。經查閱大量文獻,有關黑果枸杞的研究多見營養成分[16]和花色苷[17]、花青素[18-20]、多糖[21-22]等成分的提取分離研究。黑果枸杞多酚提取工藝研究未見報道。近年來,由于植物多酚在抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護神經等方面顯示出良好作用而具有廣泛的應用前景[23-24],成為生命科學領域研究的熱點之一。

植物多酚的提取方法主要有溶劑法、金屬離子沉淀法、層析法、超臨界二氧化碳萃取法、濾膜發、超聲輔助法、微波萃取法等。其中,超聲輔助法利用超聲波的機械效應、空化效應及熱效應,加強了細胞內物質的釋放與擴散,從而加速了有效成分的浸出。超聲輔助法與溶劑法均有操作簡便、提取溫度低、提取物結構不易破壞等優點。因此,本文采用溶劑法和超聲輔助法對黑果枸杞多酚進行了提取,利用Box-Behnken(BB)響應面法優化了工藝參數,并對兩種提取方法進行了比較,為黑果枸杞多酚的深入研究,應用開發提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表1 響應面試驗因素及水平設計Table 1 Factors and levels in response surface design

黑果枸杞 產自甘肅省民勤縣;沒食子酸標準品(質量分數90.8%) 中國食品藥品鑒定研究院;福林酚試劑 實驗室自制;無水碳酸鈉 上海朗瑞精細化學品有限公司。

BSA224S型電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司;FZ102微型植物試樣粉碎機北京中興偉業儀器有限公司;SB-5200DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司;800離心機 常州國華電器有限公司;7230G可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;DHG型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;HHS電熱恒溫水浴鍋 上海醫療器械五廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑果枸杞多酚提取方法 黑果枸杞經過陰干、粉碎,過100目標準篩,放入干燥器中,-5 ℃保存、備用。準確稱取黑果枸杞粉末0.5 g,置于100 mL錐形瓶中,加入一定量的溶劑。分別依據不同工藝條件采用溶劑法和超聲輔助法進行多酚提取,其中溶劑法選取乙醇體積分數(30%、40%、50%、60%、70%、80%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g)、提取溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)、提取時間(20、40、60、80、100、120、140、160 min)四個因素,固定因素水平為乙醇體積分數60%、液料比50∶1 mL/g、提取溫度50 ℃、提取時間40 min。超聲輔助法選取乙醇體積分數、液料比、提取溫度(與溶劑法選取水平相同)、提取時間(10、20、30、40、50、60、70 min)、超聲功率(120、150、180、210、240、270、300 W)五個因素,固定因素水平為乙醇體積分數60%、液料比50∶1 mL/g、提取溫度40 ℃、提取時間30 min、超聲功率240 W。將提取液離心,取上清液及洗滌液于50 mL容量瓶中、定容、搖勻,測定其多酚含量并計算提取率。

1.2.2 標準曲線配制 質量濃度范圍為9.325～65.276 μg/mL的沒食子酸標準溶液,采用Ainsworth等[25]的方法繪制沒食子酸標準曲線為A=0.01265C+0.02558(R=0.99877),總多酚提取率(TPC)以沒食子酸當量計,單位mg/g。

1.2.3 黑果枸杞多酚得率的測定 參照Ainsworth等[25]的方法并修改如下:將“1.2.1”中定容好的提取液稀釋一定倍數,即得測試液。取1 mL測試液于10 mL具塞試管中,加入1.5 mL福林酚試劑稀釋液(V蒸餾水/V福林酚試劑=3∶1),靜置5 min,加入1.5 mL7.5% Na2CO3溶液,用蒸餾水稀釋至刻度線、搖勻,黑暗中反應1 h,測定吸光度測定。根據“1.2.2”中的標準曲線計算測試液中多酚濃度,并根據式(1)計算多酚得率。

式(1)

其中:Y為多酚得率,mg/g;C為測試液多酚質量濃度,μg/mL;m為原料質量,g;DF:稀釋倍數,50/3;50為提取液體積,mL;1000:單位換算系數。

1.2.4 Box-Behnken響應面法優化 以單因素實驗結果為依據,采用Minitab 17.1.0軟件進行Plackett-Burnman試驗設計,對兩種提取方法的影響因素進行顯著性篩選,發現在溶劑法中,顯著性影響因素為乙醇體積分數、提取溫度和提取時間,而在超聲輔助法中,顯著性影響因素為液料比、提取溫度、提取時間。以顯著性影響因素為研究對象,非顯著性影響因素保持單因素實驗中的最優水平,分別進行三因素三水平響應面優化試驗,試驗因素及水平見表1。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次。采用Origin 8.0軟件作圖,利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面設計及優化分析。

2 結果與分析

2.1 兩種提取方法的單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數對多酚得率的影響 由圖1可知,兩種提取方法提取率均隨乙醇體積分數的增大先增大后減小,并且均在乙醇體積分數為60%時達到最高點。根據相似相容原理,60%乙醇的極性和黑果枸杞多酚類化合物的極性相當,故此時得率達到最高。所以,溶劑法選擇乙醇體積分數60%進行響應面優化設計,超聲輔助法響應面實驗中,乙醇體積分數保持60%。

圖1 乙醇體積分數對多酚得率的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on the yield of polyphenols

2.1.2 液料比對多酚得率的影響 由圖2可知,溶劑法和超聲輔助法中,隨著液料比的增大,得率均逐漸增大,液料比達到50∶1 mL/g后,多酚得率變化不明顯。可能是隨著液料比增加,使得提取劑和黑果枸杞原料能夠充分接觸,并且在提取時間范圍內能夠保持較大的傳質推動力,故得率增加,液料比達到50∶1 mL/g之后,雜質溶出率增大,多酚基本已經達到了最大溶出率,所以得率變化不大。所以,超聲輔助法選擇液料比50∶1 mL/g進行響應面優化設計,溶劑法響應面實驗中,液料比保持50∶1 mL/g。

圖2 液料比對多酚得率的影響Fig.2 Effects of liquid to solid ratio on the yield of polyphenols

2.1.3 提取溫度對多酚得率的影響 由圖3可知,兩種提取方法,隨著提取溫度的增大,得率均先增大后減小,原因可能是,溫度較低時,多酚類成分在提取劑中的溶解度較小,溫度高于某值時,又會導致多酚類化合物的降解,因此存在一個適宜的溫度值使得得率最高。其次,可以看出,超聲輔助法在提取溫度為40 ℃時得率達到最大,而溶劑法在50 ℃達到最大,可能是超聲輔助提取的空化效應和熱效應使得超聲輔助法比溶劑法所需的適宜提取溫度低。所以,超聲輔助法與溶劑法分別選擇提取溫度為40與50 ℃進行響應面優化設計。

圖3 提取溫度對多酚得率的影響Fig.3 Effects of temperature on the yield of polyphenols

2.1.4 提取時間對多酚得率的影響 由圖4可知,溶劑法和超聲輔助法中,隨著提取時間的延長,得率均先增大后減小,可能是提取時間較短時,多酚類成分沒有有效溶出,未達到溶解平衡;而提取時間過長,一方面長時間處于被加熱狀態下,多酚可能會降解;另一方面,雜質溶出量增大,故導致多酚得率下降。從圖4中還可以看出,超聲輔助法在提取30 min時得率達到最大,而溶劑法在40 min時達到最大,說明超聲輔助提取效率高。所以,超聲輔助法與溶劑法分別選擇提取時間為30與40 min進行響應面優化設計。

圖4 提取時間對多酚得率的影響Fig.4 Effects of time on the yield of polyphenols

圖5 超聲功率對多酚提取率的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.1.5 超聲功率對多酚得率的影響 由圖5可知,在超聲輔助法中,隨著超聲功率的增大,得率均呈現先增大后減小的趨勢,并且在240 W時,得率達到了最大值,從總趨勢看,超聲功率對得率的影響不顯著。超聲輔助法響應面實驗中,超聲功率保持240 W。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 BB experimental design and results

表3 溶劑法方差分析結果Table 3 BB design ANOVA results of Solvent Extraction

2.2 兩種提取方法的響應面試驗及結果

采用Box-Behnken進行響應面試驗設計,結果見表2。

依據表2中的實驗數據,采用Design expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合并進行統計分析,溶劑提取法得到的數學模型為Y=35.58+1.34A+0.94B-0.80C+0.29AB-1.54AC+1.00BC-1.72A2-1.16B2-3.08C2,其方差分析結果見表3。超聲輔助法得到的數學模型為Y=39.55+0.45A-0.85B+0.17C+0.29AB+0.55AC+0.16BC-3.53A2-0.94B2-1.58C2,其方差分析結果見表4。

表4 超聲輔助法方差分析結果Table 4 BB design ANOVA results of Ultrasonic-assisted Extraction

圖6 溶劑法響應面3D圖Fig.6 Response surface graph of solvent extraction

圖7 超聲輔助法響應面圖Fig.7 Response surface graph of ultrasonic-assisted extraction

由圖6、圖7可以看出,任意兩個顯著性影響因素所形成的響應曲面均呈現中心凸起四周下降的趨勢,說明溶劑提取和超聲輔助提取實驗中,響應面選取水平范圍準確,并且在選取的實驗水平范圍內,兩種提取方法均存在黑果枸杞多酚的最高得率,說明通過兩種模型預測的最佳提取工藝均科學合理。

采用Design expert 8.0.6軟件對兩種提取方法所得二次多項式進行解析,并根據儀器的實際操作范圍進行近似處理,得到黑果枸杞多酚溶劑法最佳工藝條件為:乙醇體積分數70%,提取溫度58 ℃,提取時間37 min,液料比50∶1 mL/g;超聲輔助提取最佳工藝條件為:液料比50∶1 mL/g,提取時間31 min,提取溫度36 ℃,乙醇體積分數60%,超聲功率240W。

2.3 驗證實驗

在模型預測的最佳工藝條件下,每種提取方法分別進行3次平行驗證實驗,實際提取率取平均值,實驗結果如表5所示。

表5 驗證實驗結果Table 5 Results of verification tests

由表5可知,兩種提取方法的實際得率與預測值的相對標準偏差均小于1%,說明優化模型具有良好的預測能力,實驗中所得最佳提取工藝準確、可靠。

2.4 提取方法比較

本文對溶劑法和超聲輔助法對黑果枸杞多酚的最佳提取工藝條件及得率進行了比較,如表6所示。

表6 溶劑法與超聲輔助法的比較Table 6 Comparison on solvent extraction and ultrasonic-assisted extraction

由表6可知,首先最佳乙醇體積分數溶劑法是超聲輔助法的1.16倍、液料比相同,說明采用溶劑法,有機溶劑乙醇的消耗量較超聲提取法大、提取成本提高;其次,溶劑法的提取溫度比超聲輔助法高22 ℃,并且超聲輔助法較溶劑法提取時間縮短16.22%,說明溶劑法能耗高、持續時間長,使得提取操作費用大大增加,并且較高的溫度容易導致多酚降解而使得得率下降,可以看出溶劑法得率較低。

超聲輔助法中,超聲波振動是能產生并傳遞強大的能量,引起多酚以較大的傳質速率進入提取劑中,同時在液相中還會產生空化作用,即在有相當大的破壞力的作用下,液體內形成空化泡的現象,從而提高提取效率。

3 結論

本研究通過單因素實驗和響應面法分別優化了溶劑法和超聲輔助法提取黑果枸杞多酚的工藝參數,并對兩種提取方法進行了比較。得出溶劑法提取黑果枸杞多酚的最佳參數為:乙醇體積分數70%,提取溫度58 ℃,提取時間37 min,液料比50∶1 mL/g,多酚得率為35.9021 mg/g,與理論預測值的相對標準偏差為0.95%。;超聲輔助法提取黑果枸杞多酚的最佳參數為:乙醇體積分數60%,液料比50∶1 mL/g,提取溫度36 ℃,提取時間31 min,超聲功率240 W,黑果枸杞多酚的得率可達39.6845 mg/g,與理論預測值的相對標準偏差為0.29%。超聲輔助法工藝簡單、經濟、省時、能耗低、提取率高,更適合黑果枸杞多酚類成分的提取。研究結果可為黑果枸杞多酚開發應用、深入研究提供了一定的理論依據。