肺炎克雷伯菌CRP蛋白表達與純化及生物學特征分析

徐 麗,邱雪梅,駱海龍,3,楊 靖,李 蓓,汪靜杰,4,*

(1.湖北醫藥學院基礎醫學院,湖北十堰 442000; 2.湖北醫藥學院生物醫藥研究院,湖北十堰 442000; 3.湖北醫藥學院生物醫學與工程學院,湖北十堰 442000; 4.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室,湖北十堰 442000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)屬腸桿菌科,為革蘭氏陰性菌,在自然界中分布廣泛,也可寄居人體的呼吸道、腸道、鼻咽等多個部位[1-3]。研究表明可從零售肉類、海產品、蔬菜及家畜體內分離得到肺炎克雷伯菌[4-8],可經污染食品或吸入等途徑進入腸道造成機體感染[5,7]。肺炎克雷伯菌是導致院內感染中最為流行的致病因子之一,還能引發社區獲得性感染[9-10];所致感染包括化膿性肝膿腫、肺炎、尿道等,同時還可引起腦膜炎、眼內炎等并發癥[11-12]。肺炎克雷伯菌作為院內感染中6種危害性最大的病原菌之一,其威脅程度僅次于大腸埃希菌[13-14]。故研究揭示肺炎克雷伯菌的致病及調控機制具有重要意義。

細菌轉錄因子在其生長代謝及毒力等方面具有重要作用,通過調控特定靶基因而發揮相應功能。大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等眾多細菌中均存在由轉錄因子間、轉錄因子與靶基因間組成的復雜調控網絡,能參與其生長、毒力及生物膜形成等許多生物過程而發揮重要作用[15-16]。肺炎克雷伯菌作為腸道致病細菌,可污染食物與肉類通過食源途徑引起感染,嚴重威脅人的健康[5-6]。研究肺炎克雷伯菌轉錄調控因子,尤其是在致病性及與腸道因子互作過程中具體調控功能,對于揭示肺炎克雷伯菌致病機制具有重要作用。

肺炎克雷伯菌中存在較多轉錄調控因子,如RcsCDB、TreC、Fur、MhbR等參與調控毒力因子的表達及其致病性[17-22]。肺炎克雷伯菌crp基因(KP1_RS23625)編碼的環磷酸腺苷受體(Cyclic AMP receptor protein,CRP)蛋白;CRP為全局轉錄調控因子,在較多細菌中普遍存在且與病原菌致病性密切相關,如鼠疫耶爾森菌、霍亂弧菌的CRP蛋白可調控毒力因子靶基因的表達,促進細菌致病性[23-24]。研究表明肺炎克雷伯菌CRP蛋白能調控其毒力因子莢膜、菌毛等以影響細菌毒力,還可使細菌逃逸宿主免疫系統的殺傷作用[25]。肺炎克雷伯菌CRP調控相關靶基因的具體機制不甚清楚,有待深入研究;且目前關于CRP蛋白功能、結構及理化性質等特征尚不明確。為了進一步揭示全局轉錄調控因子CRP調控肺炎克雷伯菌毒力的機制,本研究克隆了crp基因并成功構建CRP蛋白的外源重組表達載體pET-28a-crp。同時進行了重組蛋白的原核誘導表達與純化,并通過生物信息手段對CRP蛋白相關的多個重要特征與指標進行了預測分析;以期為后續肺炎克雷伯菌CRP蛋白的生物學功能及其致病調控機制研究提供重要參考,同時也為預防食源性肺炎克雷伯菌的感染性疾病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肺炎克雷伯菌(NTUH-K2044) 分離自臨床肝膿腫患者,為K1血清型,由軍事醫學科學院微生物流行病研究所贈送;大腸埃希菌BL21(DE3)和DH5(及表達質粒pET-28a 由本實驗室保存;酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂 英國Oxoid公司;T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、dNTPs Takara公司(中國大連);核酸產物純化試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Ni-NTA柱 德國Qiagen公司;限制性內切酶BamHI和HindIII 美國NEB公司;蛋白分子質量Marker 美國Thermo Fisher公司;核酸分子質量Marker、蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液 中國碧云天公司;PCR擴增引物 上海生工生物公司。

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;THZ-82B型恒溫搖床 常州國旺儀器設備有限公司;5424R高速離心機 德國Eppendorf公司;恒溫培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設計與合成 利用Primer 5.0軟件設計crp基因序列上下游引物,同時在引物兩端分別添加BamHI和HindIII酶切位點及相應的保護堿基,引物對詳細序列為:GCGGGATCCATGGTGCTTGGC AAACCG/GCGAAGCTTTTAACGGGTGCCGTAGACG;下劃線處分別為BamHI與HindIII酶切位點。

1.2.2 克隆載體的構建與驗證 以肺炎克雷伯菌野生株的基因組DNA為模板進行PCR擴增,獲得crp基因編碼區片段。提取pET-28a質粒,分別對pET-28a和PCR產物進行雙酶切,酶切產物用試劑盒純化回收,然后利用T4連接酶將純化回收的pET-28a與PCR產物在室溫下連接4 h。制備大腸埃希菌 BL21 感受態細胞,并通過化學熱激法將連接產物pET-28a-crp轉化入感受態細胞內,轉化產物立即37 ℃,200 r/min,活化2 h,取200 μL涂布于含卡那霉素的LB固體平板上,37 ℃培養過夜。挑取單菌落100 ℃,10 min取上清作為模板,以方法1.2.1中引物對進行PCR擴增,瓊脂糖電泳鑒定重組克隆菌;將結果陽性的單克隆菌進一步測序驗證。

1.2.3 CRP蛋白的表達與純化 挑取測序驗證正確、無突變的陽性克隆接種于含卡那霉素的3 mL LB肉湯中,37 ℃,200 r/min培養過夜,取1 mL菌液轉接于加入200 mL LB肉湯中,繼續培養3～6 h至對數期,加1 mmol/L IPTG后20 ℃,110 r/min,誘導表達6 h,8000 r/min,2 min收集菌體加入預冷的PBS重懸洗滌兩次,加入15 mL Lysisbuffer充分混勻菌體,在冰浴中超聲破碎細菌,4 ℃,12000 r/min離心30 min,取上清液。

將上清液經預冷裂解液平衡過的鎳柱Ni-NTA緩慢地流下3～5次,用pH9.5的Washbuffer(咪唑濃度分別為20和40 mmol/L)梯度法洗去雜蛋白,隨后用洗脫液(含250 mmol/L的咪唑)洗下目的蛋白,并將洗脫的蛋白溶液加入透析袋以PBS透析過夜獲取純化蛋白,通過BSA法蛋白定量后分裝、-80 ℃保存備用。取適量純化的CRP蛋白按比例與蛋白上樣緩沖液混勻,100 ℃水浴10 min,12000×g離心10 min后取15 μL上清液加至12% SDS-PAGE膠中進行蛋白電泳,考馬斯染色、脫色后分析蛋白純度。

1.2.4 CRP蛋白生物信息學分析 運用ProtParam分析CRP蛋白的理化性質;Protscale分析蛋白的疏水性;SignalP4.1 Service分析蛋白的信號肽;TMHMM Server v.2.0分析蛋白的跨膜區域;SOPMA預測蛋白的二級結構;SWISS-MODEL對CRP蛋白進行三級結構同源建模;利用NCBI的CDD(Conserved Domain Database)數據庫預測CRP蛋白的結構域;Net Phos 3.1 Sever 在線工具預測CRP蛋白的磷酸化位點;利用ATRING 11.0數據庫分析與CRP蛋白的互作蛋白。

1.3 數據處理

蛋白濃度測定采用BSA方法,每組重復3次;蛋白三級結構通過SWISS-MODEL在線軟件基于與數據庫中已知結構比對利用串線法運算建模;蛋白磷酸化位點分析基于Net Phos 3.1 Sever軟件對目的蛋白氨基酸包含的殘基與激酶位點預測數值進行String 字符串算法。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pET-28a-crp的構建及鑒定

以肺炎克雷伯菌的DNA為模板,PCR擴增crp基因,電泳檢測其大小約600 bp。將PCR產物純化連接至表達質粒pET-28a,獲得重組載體pET-28a-crp,挑取單菌落進行PCR驗證和測序驗證重組載體構建成功。PCR結果如圖1所示,且重組質粒目的基因片段測序結果與肺炎克雷伯菌crp基因序列大小一致,說明重組表達載體構建成功。

圖1 克隆PCR的鑒定結果Fig.1 Identification of crp gene PCR amplification注:M:DL2000 DNA Maker,1:PCR擴增crp基因產物。

2.2 CRP蛋白的表達純化

肺炎克雷伯菌CRP蛋白由菌株的crp基因編碼,預測的分子量為23.655 kDa(Dalton,Da)。按照方法1.2.3的步驟表達并純化獲得了CRP蛋白(圖2),SDS-PAGE電泳檢測所得目的蛋白分子量大小與通過DNAStar軟件分析預測的重組蛋白總大小相符,約為27 kDa(包括組氨酸標簽蛋白等約4 kDa)、蛋白純度,且具有較高濃度(約為0.8 mg/mL),說明本研究中采用的原核表達純化目的蛋白方法合適、滿足實驗要求,可為候選深入研究CRP對候選基因的調控作用以及與宿主互作、肺炎克雷伯菌感染疾病的防控靶點研究奠定基礎。

圖2 純化CRP蛋白的電泳結果Fig.2 Purified CRP protein was analyzed by SDS-PAGE注:M:蛋白分子質量標準;1:CRP重組蛋白。

2.3 CRP蛋白的生物信息學分析

2.3.1 CRP蛋白的基本理化性質 利用ExPASy中的ProtParam軟件預測CRP蛋白的分子式為C1049H1703N291O309S10,相對分子質量為23656.43,理論等電點(pI)為8.38,原子總量為3362;哺乳動物體外半衰期約為30 h,酵母體內>20 h,大腸埃希菌體內>10 h。不穩定系數為31.78,小于穩定蛋白閾值40,說明CRP為穩定蛋白;親水性平均系數為-0.222,可能為親水性蛋白;脂肪族指數為97.48。

CRP蛋白由20種氨基酸構成,其中Ile(I)含量占8.1%,Leu(L)含量占10.5%,Trp(W)含量占1.0%,具體見表1;帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數為26,帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數為24。

利用Protscale在線分析CRP蛋白的親水性,選用Kyte & Doolittle模式計算方法,設置氨基酸親水與疏水性峰值分析圖譜間隔的長度值為21,所得結果見圖3;圖3中負值“低谷”峰區域表示親水峰,正值高峰區域代表疏水峰,根據所預測氨基酸的親水峰與疏水峰值綜合結果可知,CRP蛋白序列中親水的氨基酸區域多于疏水區域,且親水峰的數值總體上高于疏水峰的值;表明CRP蛋白為親水蛋白,與ProtParam預測結果一致;同時通過原核誘導表達、純化及電泳檢測獲得可溶性目的蛋白結果所驗證。

表1 CRP蛋白質的氨基酸組成分布情況Table 1 Amino acid composition of CRP protein

圖3 CRP蛋白的親水性分析Fig.3 Hydrophilicity analysis of CRP protein

2.3.2 CRP蛋白的跨膜結構及信號肽 利用TMHMM Server v.2.0軟件對CRP蛋白的跨膜拓撲結構進行預測,預測的跨膜螺旋數值為0,說明CRP蛋白不存在跨膜區結構。Exp number of AAs in TMHs(預期的膜內螺旋氨基酸數)為0.00166(數值>18可能為跨膜蛋白),說明CRP蛋白為非跨膜蛋白(圖4)。利用SignalP 4.0 Server軟件對CRP蛋白的信號肽進行預測分析,結果見圖5,圖5中所示表征含信號肽的參數S值(信號肽長度預測值)、C值(氨基酸切割位點數值)、Y值(S值與C值組合)均較低;此外D值(S值與Y極值的加權平均值)為0.119,小于含信號肽蛋白D值的基本值0.500。綜合以上結果,說明目的蛋白無信號肽,不屬于分泌蛋白。

圖4 CRP蛋白的跨膜螺旋區預測Fig.4 Transmembrane domain prediction of CRP protein

圖5 CRP蛋白的信號肽預測Fig.5 Signal peptide predictionof CRP protein

2.3.3 CRP蛋白的二級結構 利用SOPMA在線分析對CRP蛋白的二級結構進行預測,結果見圖6。CRP蛋白二級結構中α-螺旋(Alpha helix,Hh)占43.81%,延伸鏈(Extended strand,Ee)占23.33%,β-轉角(Beta turn,Tt)占7.62%,無規則卷曲(Random coil,Cc)占25.24%。

圖6 CRP蛋白的二級結構Fig.6 Schematic diagram of secondary structure of CRP protein注:藍、紫、紅、綠區域分別代表α-螺旋、 無規卷曲、延伸鏈和β-轉角。

2.3.4 CRP蛋白的三級結構 利用ExPASy中SWISS-MODEL蛋白數據庫對CRP蛋白進行三級結構同源建模,模板序列為1g6n.1.A,序列相似度為99.52%,結果見圖7。

圖7 CRP蛋白的三維模型Fig.7 Three-dimensional model of CRP protein

2.3.5 CRP蛋白的結構域 利用NCBI的CDD(Conserved Domain Database)數據庫預測CRP蛋白的結構域,結果見圖8。CRP蛋白含有一個結構域,屬于PRK11753超級家族。

圖8 CRP蛋白的結構域預測Fig.8 Prediction of the domain of CRP protein

2.3.6 CRP蛋白磷酸化位點 利用Net Phos 3.1 Sever 在線工具預測CRP蛋白的磷酸化位點,結果見圖9。CRP蛋白有多個磷酸化位點,磷酸化能力超閾值的有9個絲氨酸,6個蘇氨酸,5個酪氨酸,即CRP蛋白共有20個磷酸化位點,unsp(26/41/42/91/99/100/118/129)、PKC(29/91/99/141/169/183)、Cdc2(180)、INSR(24)、SRC(41)、PKA(47)、DNAPK(119)、RSK(119)。

圖9 CRP蛋白的磷酸化位點預測Fig.9 Prediction of phosphorylation site of CRP protein

2.3.7 CRP蛋白的交互作用 利用ATRING 11.0交互式數據庫對CRP蛋白進行蛋白質交聯分析,結果顯示:JG24-23620為其同源蛋白,且與CRP蛋白作用的蛋白質主要為RNA聚合酶σ因子rpoD與rpoS、RNA聚合酶α亞基rpoA、RNA聚合酶β亞基rpoB 與JG24-26820、RNA聚合酶ω亞基rpoZ,及腺苷酸環化酶cyaA、假定蛋白JG24-23625、環磷酸腺苷磷酸二酯酶JG24-21680、轉錄調控因子JG24-26120等。CRP作為細菌全局轉錄因子在其生長與毒力方面可發揮眾多重要作用[23-25],基于此并結合該交互分析結果暗示CRP蛋白發揮相關功能時可能協同其他多個蛋白參與特定的生理生化途徑。

圖10 CRP蛋白的相互作用蛋白預測Fig.10 Interaction protein prediction of CRP protein

3 結論

肺炎克雷伯菌轉錄調控因子CRP蛋白與毒力密切相關,且CRP正調控細菌致病性以及重要的毒力因子菌毛與莢膜的生成。結合以上研究背景,本研究首先克隆crp基因并成功構建外源重組蛋白表達載體,同時誘導蛋白表達、純化出了目的蛋白;進一步利用生信方法對CRP蛋白的生理生化特征進行了預測分析,結果顯示:CRP蛋白為親水蛋白,與體外誘導表達后為可溶性表達形式檢測結果一致;無信號肽、跨膜區域;屬PRK11753超家族蛋白;二級結構較松散,主要由α螺旋與不規則卷曲構成;含有多個磷酸化位點,可與包括具有重要調控功能在內的多個蛋白發生互作,推測與CRP蛋白作為全局轉錄調控因子在發揮多種調控功能過程中協同其他蛋白質發揮重要作用有關。本研究所獲得CRP蛋白的一些關鍵生物學特征的結果可為后續肺炎克雷伯菌CRP功能與致病機制研究提供理論依據,也為其感染疾病的防控奠定了基礎。