蛹蟲草固態發酵聯產多糖和纖溶酶的工藝優化

王明瑞,鄧永平,2,*,宋青燕,陳悅彬,劉曉蘭,2

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,黑龍江齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室,黑龍江齊齊哈爾 161006)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)為藥食同源大型真菌,在中華人民共和國衛生部2009年第3號公告中被正式批準為新資源食品,在衛生計生委2014年第10號公告中被納入新食品原料。蛹蟲草中含有多種生物活性成分[1-2],其中多糖是蛹蟲草子實體、菌絲體或發酵液中含量最豐富的活性成分,具有抗高血脂[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、免疫調節[6]等功效,已成為蛹蟲草功能食品開發和質量控制的指標之一[2]。研究表明,蛹蟲草發酵菌絲體多糖含量較人工栽培子實體多糖含量高約10%(m/m),在同等濃度下對腫瘤細胞的抑制率高約20%[7-8],因此,利用發酵法生產蛹蟲草多糖更加經濟有效。

血栓栓塞性疾病嚴重危害人類的生命和健康。纖溶酶能夠將構成血栓的纖維蛋白凝塊降解為小分子代謝物,具有溶解血栓或者降低血栓傾向的功能[9]。因此,含有纖溶酶的保健食品或藥品的研發一直是熱點。從藥食同源大型真菌中提取纖溶酶作為功能性食品添加劑或藥物用于預防和治療血栓性疾病已展現出巨大的潛力[9]。目前,已經報道了多種來自大型真菌的纖溶酶,例如:冬蟲夏草(Cordycepssinensis)[10]、金針菇(Flammulinavelutipes)[11]、杏鮑菇(Pleurotuseryngii)[12]、裂褶菌(Schizophyllumcommune)[13]、本占地菇(Lyophyllumshimeji)[14]、平菇(Pleurotusostreatus)[15]、蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)[16]等。

基于蛹蟲草珍貴的食藥用價值,開發蛹蟲草或其代謝產物的研究工作一直在進行。陳慧鑫等[17]通過對葡萄糖和豆粕發酵工藝的優化同時獲得了蛹蟲草菌絲體和纖溶酶。Wang等[18]確定重復分批培養方法生產蛹蟲草胞外多糖的碳氮源分別是葡萄糖和酵母提取物。Yang等發現以蔗糖和酵母提取物為底物時蛹蟲草CGMCC 2909可聯產菌絲體、多糖、腺苷和甘露醇[5]。Dang等[19]研究了生長因子和谷物對蛹蟲草菌絲體生長和代謝產物的抗氧化活性影響,確定在葡萄糖培養基中加入糙米、白米、小麥等谷物有助于蛹蟲草菌絲體的生長和產物合成。Xiao等[20-23]研究了蛹蟲草發酵對鷹嘴豆、綠豆、紅豆、燕麥的抗氧化性能的影響,確定通過發酵提高了產物的抗氧化能力,為蛹蟲草功能食品的生產奠定了基礎。

玉米位列五谷之首,被稱為“黃金作物”。但是由于玉米粉中缺乏面筋蛋白,所以限制了其主食化應用[24]。研究表明,經過微生物發酵后的玉米粉熱穩定性和抗回生性均有所提高,在食品加工上更具有開發潛力[25]。另外,有報道證明玉米粉為基質能有效提高大型真菌多糖含量[26]。本論文以玉米粉為主料,以胞外多糖含量和纖溶酶的活力為指標,研究了蛹蟲草固態發酵聯產胞外多糖和纖溶酶的工藝條件。與已有同類研究相比,本文的研究既有利于提高玉米資源的生物利用度,又能同時獲得兩種高附加值的產物。通過本文的研究有望為開發含蛹蟲草天然功能因子的食品原料提供技術參考,為玉米深加工提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草菌(Cordycepsmilitaris) 分離自大興安嶺林區,現保存于黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室;馬鈴薯、玉米粉、麩皮 購自齊齊哈爾市瀏園市場;牛血纖維蛋白原、牛凝血酶(500 U/mL) 購自中國醫學科學院天津血研所;MgSO4、KH2PO4、蛋白胨、葡萄糖、苯酚 分析純,購自天津市凱通化學試劑有限公司。

himac CF15RX冷凍離心機 天美科學儀器有限公司;SPX-150BS-Ⅱ生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養方法 斜面培養基及培養方法:斜面培養基由葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、馬鈴薯200 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、瓊脂20 g/L組成。將蛹蟲草菌株劃線接種至斜面上,在23 ℃培養7 d。平板培養基及培養方法:培養基組成同斜面培養基。挑取斜面培養物劃線接種至平板表面,在23 ℃培養15 d。種子培養基及培養方法:種子培養基由葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、馬鈴薯200 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L組成,250 mL三角瓶裝入100 mL液體種子培養基。用無菌打孔器在平板培養物上取出直徑1.5 cm的菌塊,接種到種子培養基中,23 ℃、180 r/min振蕩培養5 d。

1.2.2 營養物比例的選擇 培養容器為250 mL三角瓶,培養基干基重20 g,其中玉米粉和麩皮的質量比分別為20∶0、19∶1、18∶2、17∶3、16∶4 (g/g),加水量為10 mL,加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),接種10%(V/m)種子培養液,23 ℃培養3 d,檢測胞外多糖含量和纖溶酶活力。

1.2.3 培養基料水比例的確定 250 mL三角瓶中加入18 g玉米粉和2 g麩皮,干物質與水的質量體積比分別為2∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2 (m/V),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),接種10%(V/m)種子培養液,23 ℃培養3 d,檢測胞外多糖含量和纖溶酶活力。

1.2.4 接種量的確定 250 mL三角瓶中加入18 g玉米粉和2 g麩皮,料水比例為1∶1 (m/V),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),分別接種1%、3%、5%、7%、10%、15%、20%(V/m)種子培養液(種子培養液的加入體積計入培養基添加總水分含量中),23 ℃培養3 d,檢測胞外多糖含量和纖溶酶活力。

1.2.5 培養時間的確定 250 mL三角瓶中加入18 g玉米粉和2 g麩皮,料水比例為1∶1 (m/V),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),接種7%(V/m)種子培養液,23 ℃分別培養2、3、4、5 d,檢測胞外多糖含量和纖溶酶活力。

1.2.6 培養溫度的確定 250 mL三角瓶中加入18 g玉米粉和2 g麩皮,料水比例為1∶1 (m/V),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),接種7%(V/m)種子培養液,分別在21、23、25 ℃分別培養3 d,檢測胞外多糖含量和纖溶酶活力。

1.2.7 正交試驗優化培養條件 在單因素實驗基礎上利用L9(34)正交試驗設計進一步優化培養條件,優化因素分別為接種量(A)、培養時間(B)和培養溫度(C),選取三個水平進行試驗(見表1)。

1.2.8 發酵產物的處理 向固態發酵物中加入100 mL蒸餾水,在23 ℃、150 r/min條件下浸提4 h,4 ℃、6000 r/min離心10 min,收集上清液,置4 ℃冰箱中保存。

1.2.9 纖溶酶活力的測定 采用血纖維蛋白平板法測定蛹蟲草纖溶酶活力,平板制備方法和酶活力測定方法見文獻[17]。取10 μL上清液點加于血纖維蛋白平板表面,37 ℃保溫6 h后測定溶圈面積。血纖維蛋白是構成血栓的主要成分,纖溶酶活力與其在血纖維蛋白平板上形成的溶圈面積呈正相關。由于不同批次市售尿激酶標定活力單位存在差異,致使標準曲線不統一,因此本文以纖溶酶在血纖維蛋白平板上形成的溶圈面積表示酶活力。

1.2.10 胞外多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測胞外多糖含量[18]。標準曲線方程為:y=0.14394x+0.0028,其中y為多糖含量,單位為mg/mL,x為490 nm處的吸光值,R2=0.9923。

1.3 數據處理

利用Excel 2003和SPSS 11.5分析軟件對數據進行統計分析,所有實驗均重復三次,采用Duncan氏法進行多重比較,圖中同系列柱狀圖或折線圖上標不同小寫或大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 玉米粉與麩皮比例的選擇

在固態發酵過程中,培養基中較大的孔隙度能更好的滿足氧氣流通,促進菌絲生長[27]。蛹蟲草菌絲體對氧氣需求較高,因此選擇麩皮作為固態培養基的疏松劑,同時麩皮含有淀粉和纖維,還能起到碳源的作用。研究了玉米粉與麩皮的比例對胞外多糖含量和纖溶酶的活力的影響,結果見圖1。

圖1 玉米粉與麩皮比例對多糖含量和纖溶酶活力的影響Fig.1 Effect of the ratio of corn flour and wheat bran on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity注:圖中不同小寫字母表示胞外多糖含量的 差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示 纖溶酶活力的差異顯著(P<0.05),圖2～5同。

如圖1所示,適當提高培養基中麩皮的含量有助于提高多糖含量和纖溶酶活力,當玉米粉與麩皮比例為18 g∶2 g時胞外多糖含量和纖溶酶活力均顯著高于其他營養物比例(P<0.05)。當培養基中不添加麩皮或添加量為1 g時,培養基疏松性較差,不利于氧氣流通,菌體生長能力下降,導致多糖含量和纖溶酶活力降低;當培養基中麩皮含量大于2 g,玉米粉含量相應減少時,菌體生長速度減慢,導致產物合成能力下降。因此,確定營養物比例為18 g∶2 g。

2.2 培養基料水比例的確定

培養基料水比例對于營養物質的溶解狀態,以及培養基的孔隙率和生物結構的穩定性均會有較大的影響,進而對菌體生長和活性物質的積累產生一定的影響[28]。培養基料水比例對蛹蟲草胞外多糖含量和纖溶酶的活力的影響結果見圖2。

圖2 料水比例對多糖含量和纖溶酶活力的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity

由圖2可知,培養基料水比例為1∶1 (m/V)時蛹蟲草胞外多糖含量和纖溶酶活性顯著高于其他料水比(P<0.05)。在固態發酵培養基中微生物可利用的水含量與培養基溶質濃度、毛細作用力和吸收特性有關[28]。當料水比為2∶1 (m/V)時,微生物可利用的水分極少,不利于營養物質胞外降解和吸收,導致菌體生長和代謝產物合成受到抑制。真菌菌絲延伸以及孢子萌發和產物合成對水分脅迫很敏感[28],當料水比為1∶1.5、1∶2 (m/V)時,培養基粘稠度提高,不利于氧氣流通,水分對菌體生長和產物合成的脅迫導致多糖含量和纖溶酶活力降低。不同的料水比對大型真菌發酵產生物活性物質具有不同的影響,例如蛹蟲草發酵五味子藥渣時料水比1∶2有利于蟲草素含量的提高[29];羊肚菌發酵豆渣產胞外多糖最適料水比是1∶9[30]。在本文中,蛹蟲草發酵產胞外多糖和纖溶酶的最適料水比例為1∶1(m/V)。

2.3 接種量的確定

接種量是影響發酵效率的主要因素,接種量過小會導致菌絲體生物量低,而接種量過大會產生不必要的養分消耗,導致真菌細胞養分匱乏并在發酵階段停止生長[31]。接種量對胞外多糖含量和纖溶酶的活力的影響結果見圖3。

圖3 接種量對多糖含量和纖溶酶活力的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity

如圖3所示,當接種量為5%(V/m)時胞外多糖含量最高,但是與接種量3%(V/m)和7%(V/m)時沒有顯著性差異(P>0.05)。從以往一些報道來看,蟲草屬真菌產胞外多糖的接種量一般都比較低,如CordycepssinensisUM01產胞外多糖的最適接種量為3%(V/m)[32],CordycepsmilitarisSU5-08產胞外多糖的最適接種量為4%(V/m)[5]。從纖溶酶活力判斷,當接種量為7%(V/m)時蛹蟲草纖溶酶活力顯著高于其他接種量時酶活力(P<0.05)。因此,綜合考慮兩種產物確定接種量為7%。

2.4 培養時間的確定

隨著培養時間的進行,菌體生長并產生代謝產物,引起培養環境的變化,進而影響目標產物產量。培養時間對蛹蟲草多糖和纖溶酶的影響見圖4。

圖4 培養時間對多糖含量和纖溶酶活力的影響Fig.4 Effect of cultivation time on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity

如圖4所示,在培養蛹蟲草至2、3、4 d時胞外多糖含量沒有顯著性差異(P>0.05),但是均顯著高于第5 d的含量(P<0.05);纖溶酶活力在培養至第3 d時顯著高于其他培養時間(P<0.05)。這是因為隨著培養時間延長,營養成分逐漸消耗,導致產物合成速率下降,胞外酶的活性逐漸降低[28]。因此,確定培養時間為3 d。

2.5 培養溫度的確定

培養溫度是影響真菌生長和代謝的主要因素之一,低溫培養會減緩菌絲代謝速率,延長生產周期,高溫培養易導致菌絲快速老化,抑制產物生成[33]。在前期研究中發現,本文中蛹蟲草菌適宜在21～25 ℃條件下生長,溫度超過25 ℃會使菌種生長緩慢[17,34]。因此研究了21、23、25 ℃的培養溫度對蛹蟲草多糖和纖溶酶的影響,結果見圖5。

圖5 培養溫度對多糖含量和纖溶酶活力的影響Fig.5 Effect of cultivation temperature on polysaccharides content and fibrinolytic enzyme activity

如圖5所示,實驗范圍內的培養溫度對蛹蟲草胞外多糖含量沒有顯著影響(P>0.05);但是,培養溫度對纖溶酶活力有顯著影響,當培養溫度為23 ℃時纖溶酶活力顯著高于21和25 ℃(P<0.05)。這可能是因為胞外酶的活性對培養溫度更為敏感[33],蛹蟲草產α-半乳糖苷酶和幾丁質酶的最適溫度也是23 ℃[35-36]。

2.6 正交試驗

接種量、培養時間和培養溫度是影響固態發酵效率的主要因子[33]。根據單因素實驗結果,采用L9(34)正交試驗對蛹蟲草固態發酵玉米粉聯產胞外多糖和纖溶酶的培養條件進一步優化,結果見表2、表3和表4。

由表2可知,根據多糖均值判斷最優化組合為A2B2C2,即接種量為6%(V/m)、培養時間3 d、培養溫度23 ℃。根據極差判斷影響多糖含量的主次因素順序依次為A>B>C,即接種量>培養時間>培養溫度。根據纖溶酶溶圈面積均值判斷最優化組合為A2B2C2,即接種量為6%、培養時間3 d、培養溫度23 ℃。根據極差判斷影響纖溶酶活力的主次因素順序依次為A>C>B,即接種量>培養溫度>培養時間。

方差分析結果如表3和表4所示,實驗選擇的各因素對于胞外多糖含量沒有顯著性影響(P>0.05),但是接種量對纖溶酶活力有顯著性影響(P<0.05)。

經過發酵實驗驗證該工藝條件較穩定。最終確定蛹蟲草固態發酵玉米粉聯產胞外多糖和纖溶酶的條件為:250 mL三角瓶中裝有20 g培養基,培養基由玉米粉和麩皮組成,比例為18∶2,加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),料水比例為1∶1,接種量為6%(V/m),在23 ℃培養3 d,經100 mL蒸餾水浸提后得到的浸提液中胞外多糖含量為3.23 mg/mL,纖溶酶在血纖維蛋白平板形成的溶圈面積為169.34 mm2。

3 結論

表2 L 9(34)試驗結果Table 2 The result of L 9(34)orthogonal experiment

表3 方差分析結果(多糖)Table 3 The result of analysis of variance(polysaccharides)

表4 方差分析結果(纖溶酶)Table 4 The result of analysis of variance(fibrinolytic enzyme)

蛹蟲草胞外多糖和纖溶酶具有多種生理功效,為了更好開發蛹蟲草功能食品基料,本文以玉米粉為主料,對蛹蟲草菌固態發酵聯產胞外多糖和纖溶酶的工藝進行了研究。經過單因素和正交試驗確定了250 mL三角瓶中蛹蟲草固態發酵玉米粉聯產胞外多糖和纖溶酶的培養基構成為玉米粉和麩皮,比例為18∶2 (g/g),加入0.1% CaCl2和2%(NH4)2SO4(m/m),料水比例為1∶1 (m/V),接種量為6%(V/m),在23 ℃培養3 d,經100 mL蒸餾水浸提后得到的浸提液中胞外多糖含量為3.23 mg/mL,纖溶酶在血纖維蛋白平板形成的溶圈面積為169.34 mm2。以玉米粉為主料培養蛹蟲草聯產多糖和纖溶酶兩種功能因子,既有助于改善玉米粉的營養狀態,又賦予了培養物新的生理活性。將發酵后的玉米粉作為原料開發功能食品,將具有廣泛的應用前景。