超高效液相色譜-串聯質譜法測定楊梅的6種農藥殘留

馬婧妤， 劉 莉

(金華市農產品質量安全中心， 浙江 金華 321051)

楊梅(Myricarubra)又稱圣生梅、樹莓，是一種具有較高藥用和食用價值的水果[1-4]。全球主產區是中國的南方，占世界楊梅產量的98%，楊梅栽培面積約39萬hm2，楊梅的年產量約為100萬t，國內楊梅的主要產區在浙江、江蘇、江西、安徽、廣東、廣西和貴州等省。楊梅果樹病蟲害發生復雜，成熟后期果蠅、白腐病發生較重，影響品質和產量[5-9]。楊梅用藥過程中因為缺乏安全用藥技術指導，出現亂用和濫用的現象，特別是利益催動下頻繁地使用化學農藥、植物生長調節劑等促進楊梅的生長和成熟以及防治楊梅病蟲害，從而導致楊梅中農藥殘留的安全風險問題多，風險隱患突出[10-13]。

國內關于甲萘威、克百威、吡蟲啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯在楊梅中殘留檢測尚未見報道。為快速檢測出楊梅中甲萘威、克百威、吡蟲啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯的殘留量，借鑒標準規定和相關文獻的前處理方法，建立超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)聯用快速檢測楊梅中農藥殘留量的方法，以期為楊梅質量安全檢測和農藥合理使用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 楊梅 楊梅采購于金華市蘭溪市馬澗鎮。

1.1.2 試劑 甲萘威、克百威、吡蟲啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯(標準品，100 μg/mL，北京振翔科技有限公司)，無水硫酸鈉，正己烷均為分析純；乙腈，甲酸為色譜純。實驗用水(一級水，電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.1.3 儀器 XEVO-TQS#WAC1607超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國Waters公司)，CF6RN高速離心機(日本日立公司)，BSA2202S電子天平(德國賽多利斯公司)，T25渦旋振蕩器(德國IKA公司)，N-EVAP氮吹儀(Organomation公司)，HY-4調速多用振蕩器(金壇盛藍)。

1.3色譜與質譜條件

1.3.1 色譜 色譜柱：BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：A相，5 mmoL乙酸銨-0.1%甲酸水溶液；B相，甲醇；流速：0.45 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：1 μL；洗脫方式：梯度洗脫，B相初始濃度為5%。梯度洗脫條件見表1。

表1液相色譜流動相洗脫條件

1.3.2 質譜 離子化模式：ES(+)；源溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱氣：空氣10.0 L/min；加熱模塊溫度：600℃；霧化氣：氮氣3.0 L/min；掃描模式：多反應監測(MRM)干燥氣：氮氣10.0 L/min；延遲時間：3 ms；碰撞氣：氬氣0.15 mL/min。6種農藥檢測離子對、碰撞能參數見表2。

1.4儲備液的配制和線性相關性測試

1.4.1 儲備溶液配制 移取甲萘威、克百威、吡蟲啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯農藥標準品(100 μg/mL)各1 mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，得4 μg/mL農藥混合標準溶液。吸取2.5 mL上述溶液至10 mL容量瓶，得1 μg/mL農藥混合標準溶液，備用。

1.4.2 基質匹配標準曲線 吸取不同體積的1 μg/mL的農藥混合標準溶液用1.3.2中的流動相初始溶液進行稀釋，分別得到10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL的不同濃度的溶液。濃度從低到高依次進樣測定，每一濃度進樣3次，以離子色譜峰面積為縱坐標及其相應的溶液濃度為橫坐標，以農藥標準溶液定量離子峰面積(y)及其對應的含量(x，ng/kg)進行線性回歸，繪制標準曲線。

表26種農藥定性定量離子參數

1.5樣品前處理

1.5.1 試樣制備 按GB/T 8855抽取水果樣品方法，參考GB 2763—2014標準取楊梅放入食品加工器粉碎，去核，制成待測樣。在18℃條件下保存，備用。

1.5.2 提取 準確稱取25.00 g(±0.05 g)楊梅試樣放入燒杯中，樣品盡量在燒杯底部，若粘在壁上，加乙腈時用乙腈進行沖洗。加入50.0 mL乙腈，在勻漿機中高速勻漿2 min后，濾紙過濾，蒸餾水清洗。濾液收集至裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液40～45 mL。蓋上具塞量筒塞子，劇烈震蕩1 min，打開蓋子，在室溫下靜置30 min，乙腈相和水相分層。

1.5.3 凈化 從100 mL具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈提取液于10 mL試管中，置于50℃水浴鍋中氮吹，蒸發至干，加入2.0 mL二氯甲烷+甲醇(9∶1)溶解，蓋上鋁箔，待凈化。將氨基柱用4 mL V二氯甲烷∶V甲醇為9∶1預洗。當溶劑液面達到柱吸附層表面時，立即加入上述待凈化液，用4 mL V二氯甲烷∶V甲醇為9∶1過柱后，再用同樣條件洗滌氨基柱，合并2次獲取的濾液。

將試管置于水浴35℃中，氮吹至近干，加2 mL甲醇，加入2 mL的超純水，混勻后待其冷卻，再用超純水定容至5.0 mL。在混勻器上混勻后用0.2 μm濾膜過濾，用液質分析。

1.6數據處理

按公式計算超高效液相色譜-串聯質譜測定楊梅中6種農藥殘留量。

(1)

式中：Xi,楊梅樣品中待測農殘的含量，單位為μg/kg；Ci，從標準工作曲線得到的楊梅樣品溶液中待測農殘的濃度，單位ng/mL；V，楊梅樣品溶液定容體積，單位mL；M，楊梅樣品稱樣質量，單位g。

在楊梅樣品中添加2個濃度的6種農藥標準溶液，進行添加回收率和精密度試驗，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。

2結果與分析

2.1楊梅樣品前處理優化

2.1.1 提取液 甲萘威、克百威、吡蟲啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯農藥的極性差異較大。乙腈對不同極性的物質均有較好溶解度，可以作為楊梅中農藥殘留的提取劑。而且，乙腈再提取含有大量色素的樣品是可以有效降低色素物質的干擾，大量試驗表明乙腈適合多組分同時檢測[14]。楊梅溶液呈現酸性，在乙腈中加入1%乙酸，可模擬楊梅果實的酸性環境，避免因為pH變化引起楊梅生物堿性合物的變性。

2.1.2 凈化方式 楊梅樣品在凈化過程中，有2次氮吹，且2次氮吹的溫度和最后的氮吹形態均不同。第1次凈化氮吹是濃縮樣品，將樣品中的乙腈吹除，因此氮吹后樣品需要盡可能的干燥，減少乙腈對檢測結果的干擾。溫度設在50℃，溫度過高將導致樣品中低沸點農藥損失。溫度低于50℃，氮吹的時間會延長。第2次凈化氮吹的目的是除去樣品溶液中的二氯甲烷。二氯甲烷的沸點比較低，35℃條件下可以完成氮吹。氮吹溫度過高，溶解在二氯甲烷中的農藥會隨二氯甲烷蒸發，導致回收率偏低。溶液中若有二氯甲烷將導致檢測樣品分層，渾濁，影響測量的結果。樣品溶液經過氮吹凈化，體積在1 mL以下，可以認為二氯甲烷完全去除。因為甲醇的沸點遠高于二氯甲烷，二氯甲烷優先與甲醇被蒸發。

2.2檢測條件優化

2.2.1 色譜條件 采用二元梯度洗脫，流動相A為乙酸銨與甲酸。在正離子模式下，甲酸提供H+，有利于形成[M+H]+，可以提高檢測的靈敏度；乙酸銨有助于提高農藥在保留時間內的穩定性以及保證峰形對稱。通過優化梯度、流速等試驗條件，6種農藥在10 min內全部出峰(圖1)。

圖16種農藥殘留的總離子色譜圖

2.2.2 質譜條件 在ES+模式下分別對6種農藥標準溶液進行全掃描，確定6種農藥分子離子峰[M+H]+，調節離子源電壓、錐孔電壓和碰撞氣出口流量等；以農藥分子離子峰作為母離子，進行子離子掃描，當母離子的響應強度是子離子響應強度的25%～30%為最佳調節碰撞能量參數，在質譜圖中選擇2～3個信號較強的子離子作為定性離子和定量離子，其中豐度最強的子離子作為定量離子，再進行錐孔電壓和碰撞能量等質譜參數的優化。質譜參數確定后，取50 ng/mL的混合標準溶液在優化后的色譜條件下逐個進行微調優化，使6種農藥的靈敏度、峰形達到最佳。

2.3檢測方法評價

2.3.1 方法的標準曲線、線性范圍及檢出限 由表3可見，6種農藥在10～80 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r)為0.997 156～0.999 51；以特征定量離子對色譜峰3倍的信噪比(S/N=3)確立方法的檢出限為0.4～300 ng/kg，以特征定量離子對色譜峰10倍的信噪比確立方法的定量限為1～1 092 ng/kg，能夠滿足楊梅中6種農藥殘留的定量分析要求。

表36種農藥標準曲線及相關系數

2.3.2 方法的精密度及回收率 由表4可知，楊梅中6種農藥添加樣品的回收率為87.23%～97.73%，回收率最低的是嘧菌酯，回收率偏低的原因，可能由于100 ng高濃度樣品基質干擾影響。批內的標準偏差為2.01%～6.24%。

2.4基質效應

在農藥殘留檢測時，當樣品基質比較復雜，樣品集中可能會對檢測結果造成干擾，導致目標物準確定量變得困難。對樣品采用正確的前處理方法可有效降低基質效應對檢測結果的影響[15]。試驗采用不含檢測農藥的空白楊梅樣品提取液配制系列基質標準溶液校正回收率，并采用內標法定量，盡可能地降低基質效應對結果的影響。

表4楊梅樣品中6種農藥的回收率和標準偏差 %

3小結

建立超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)測定楊梅中6種農藥殘留檢測的方法，方法的檢出限和定量限分別為0.4～300 ng/kg和1～1 092 ng/kg，測定6種農藥在10～80 ng/mL時線性關系良好(r>0.997156)，平均回收率范圍為87.23～97.73%%(n=6)。該方法相比與普通液相色譜法，定性定量準確，檢測速度提升，分離時間縮短，方法的靈敏度和分離度以及重現性較好，穩定性高，滿足楊梅中農藥殘留分析的檢測要求，同時溶劑用量大為減少，分析成本降低，檢測效率得到提升。