手足口病患兒DLL4/Notch信號通路相關蛋白的表達及意義

高榮 祖麗皮亞·達木拉

【摘要】 目的：探討手足口病患兒DLL4/Notch信號通路相關蛋白的表達及意義。方法：選擇2018年3月-2019年11月本科收治的手足口病患兒86例，其中輕癥患兒76例（普通組），重癥患兒10例（重癥組），同期選擇在本院體檢的健康小兒86例作為對照組。比較三組外周血DLL4、Notch1 mRNA表達水平與血清IL-6、IL-8、TNF-α表達水平，并進行相關性分析。結果：重癥組住院天數、發熱天數均長于普通組，休克、呼吸衰竭、EV71感染發生率均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05）。重癥組與普通組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于對照組，重癥組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05）。重癥組與普通組外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達水平均高于對照組，重癥組外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達水平均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05）。在手足口病患兒中，Pearson分析顯示DLL4、Notch1表達水平與IL-6、IL-8、TNF-α存在相關性（P<0.05）。結論：手足口病患兒伴隨著DLL4/Notch信號通路相關蛋白表達的激活，可誘發大量炎癥因子的釋放，與患者的病情存在相關性。

【關鍵詞】 手足口病 DLL4/Notch信號通路 炎癥因子 病情 相關性

Expression and Significance of DLL4/Notch Signaling Pathway Related Proteins in Children with Hand-foot-mouth Disease/GAO Rong， Zulipiya Damula. //Medical Innovation of China， 2021， 18（12）： 0-084

[Abstract] Objective： To investigate the expression and significance of DLL4/Notch signaling pathway related proteins in children with hand-foot-mouth disease （HFMD）. Method： A total of 86 children with HFMD admitted to our hospital from March 2018 to November 2019 were selected， including 76 children with mild disease （normal group） and 10 children with severe disease （severe group）， and 86 healthy children with physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. The mRNA expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of three groups were compared with the expression levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in serum， and the correlation analysis was conducted. Result： The hospitalization days and fever days in the severe group were longer than those in the normal group， and the incidence of shock， respiratory failure and EV71 infection were higher than those in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Serum levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in the severe group and normal group were higher than those in the control group， serum levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in the severe group were higher than those in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The mRNA relative expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of the severe group and the normal group were higher than those of the control group， and the mRNA relative expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of the severe group were higher than those of the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. In children HFMD， Pearson analysis showed that the expression levels of DLL4 and Notch1 were correlated with IL-6， IL-8， TNF-α （P<0.05）. Conclusion： The activation of DLL4/Notch signaling pathway related protein expression in children with hand-foot-mouth disease can induce the release of a large number of inflammatory factors， which is correlated with the patients condition.

[Key words] Hand-foot-mouth disease DLL4/Notch signaling pathway Inflammatory factors Condition

Correlation

First-authors address： Childrens Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830054， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.12.019

手足口病（hand-foot-mouth disease， HFMD）是由腸道病毒引起嬰幼兒常見急性傳染病，以皰疹、發熱、口腔疼痛為主要臨床特征的傳染病[1]。其主要的病原體為柯薩奇病毒A組16型（coxsackie virus， CA16）或腸道病毒71型（enterovirus 71， EV71），其中EV71感染具有極強的傳染性[2-3]。輕度感染患兒預后良好;重度感染患兒多伴隨著神經系統并發癥，包括腦干腦炎、無菌性腦膜炎、神經源性肺水腫、急性弛緩性麻痹，多為EV71感染引起，具有一定的致死率[4]。有研究報道顯示EV71具有親神經性，使得手足口病患兒容易出現腦炎，導致疾病惡化。DLL4/Notch信號通路是進化上比較保守的跨膜蛋白家族，主要由配體、受體、結合蛋白、調節分子、效應物等組成[5]。人體共有多種Notch配體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1）和多種Notch受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）等，其中Notch1屬于Ⅰ型跨膜蛋白，當胞外區域與配體結合后，Notch受體被解聚素和金屬蛋白酶水解，跨膜區和胞內區由γ-分泌酶復合體催化為Notch胞內區，然后進入胞核后，可水解成組蛋白去乙酰化酶、核受體輔阻遏物2等因子，從而發揮生物學調節作用[6]。當DLL4/Notch信號通路激活后，尤其是DLL4的高表達可促進CD4+ Th1淋巴細胞的分化，可誘發炎癥因子的表達，促進Treg淋巴細胞分化，從而導致疾病惡化[7]。本文具體探討了手足口病患兒DLL4/Notch信號通路相關蛋白表達的差異及意義，以明確手足口病的發生機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年3月-2019年11月本科收治的手足口病患兒86例，其中輕癥患兒76例（普通組），重癥患兒10例（重癥組），同期選擇在本院體檢的健康小兒86例作為對照組。納入標準：普通組與重癥組均符合手足口病的診斷標準，即咽拭子或肛拭子EV71-PCR或CA16-PCR檢測陽性，都有發熱癥狀;重癥組伴隨著神經系統并發癥;對照組為健康查體的小兒;研究對象年齡1～6歲;臨床資料完整。排除標準：無法安靜且對鎮靜劑過敏;合并慢性基礎疾病需長期服用糖皮質激素;合并先天性疾病;伴先天性或獲得性免疫缺陷病。研究對象家屬知情同意本研究，本院倫理委員會批準了此次研究。

1.2 方法 DLL4、Notch1 mRNA檢測：采集所有研究對象的外周血2～3 mL，抗凝，分離單個核細胞，抽提總RNA并進行逆轉錄。采用實時定量PCR方法檢測DLL4、Notch1表達水平，采用PCR Mix試劑盒進行PCR反應，總反應體系為20 μL，引物序列如下，DLL4正向引物：5-CTTGGTGTCACGCTTGCT-3，反向引物：5-GGGTCATCCTTGTCCTCAT-3;Notch1正向引物：5-AGTTCCAGTGCGATGCCTACA-3，反向引物：5-AATGGTTATCGCTGTATCTG-3，以GAPDH作為內標，做3次重復取平均值。

1.3 觀察指標 再次抽取所有患者外周血樣本

2～3 mL，不抗凝，靜置30 min后，1 000 r/min離心10 min，取上層血清，采用酶聯免疫法檢測血清IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子表達水平，比較三組血清炎癥因子表達水平。比較三組外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達水平。調查所有手足口病患兒的臨床資料，包括住院天數、發熱天數、臨床癥狀、感染病原體類型等。分析手足口病患兒外周血DLL4、Notch1表達水平與血清炎癥因子表達水平的相關性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，多組數據比較采用方差分析;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。相關性分析采用Pearson分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較 普通組中男38例，女38例;平均年齡（4.21±0.28）歲。重癥組中男6例，女4例;平均年齡（4.24±0.33）歲。對照組中男43例，女43例;平均年齡（4.28±0.33）歲。三組的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組臨床相關指標比較 重癥組的住院天數、發熱天數均長于普通組，休克、呼吸衰竭、EV71感染發生率均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 三組血清炎癥因子表達水平比較 重癥組與普通組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于對照組，重癥組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.4 三組外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達水平比較 重癥組與普通組的外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達水平均高于對照組，重癥組的外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達水平均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.5 手足口病患兒外周血DLL4、Notch1表達水平與血清炎癥因子表達水平的相關性分析 在手足口病患兒中，Pearson分析顯示DLL4、Notch1表達水平與IL-6、IL-8、TNF-α存在相關性（P<0.05），見表4。

3 討論

手足口病多發生于5歲以下小兒，在春夏季高發，多表現為發熱和手足、口腔等部位的皮疹。該病的發生與發展呈現多個階段，第一階段為常規期，第二階段為神經系統受累期，第三階段為心肺功能衰竭期，第四階段為恢復期。引發手足口病的腸道病毒比較多，其中CoxA 16和EV71最為常見。兩者都屬微小核糖核酸病毒科、人腸道病毒屬，EV71具有明顯嗜神經性，更易引起中樞神經系統感染，而CoxA 16可能為單純的手足口病患兒[8]。研究表明手足口病可分為輕癥和重癥病例，其中輕癥相當于第一階段，重癥相當于第二及其以后階段，神經系統損害是手足口病惡化的早期表現，合并病毒性腦炎也屬于第二階段[9]。輕癥患兒多只表現為口痛拒食、發熱、皮疹等癥狀，重癥患兒還伴隨有神經系統受累表現。本研究也顯示重癥組的住院天數、發熱天數均長于普通組，休克、呼吸衰竭、EV71感染發生率均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05），表明手足口病患兒的病情可能與腸道病毒EV71感染相關。

手足口病侵犯中樞神經系統可分為病毒直接侵犯所致的炎癥和機體免疫功能異常所致的急性脫髓鞘改變。炎癥改變包括神經元變性、壞死和嗜神經細胞作用，血管周圍主要單核細胞浸潤形成袖套樣改變，其病理改變主要是在腦干及脊髓，尤其灰質區可見彌漫性炎癥[10]。本研究顯示重癥組與普通組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于對照組，重癥組的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05）。從機制上分析，IL-6是一種重要的促炎性細胞因子，除對血管內皮細胞及炎性細胞具有直接激活和毒性作用外，其大量釋放也可導致機體出現功能損害與多器官細胞代謝障礙[11]。IL-8也被稱為前炎癥細胞因子，是啟動抗炎癥反應的關鍵細胞因子，可激發機體產生眾多繼發性炎癥介質。而EV71感染可以刺激機體大量釋放TNF-α，激活靶基因轉錄，引起細胞因子合成和釋放，誘發機體產生級聯“瀑布式”炎癥反應[12-13]。

在DLL4/Notch信號通路中，Notch1為一種單次跨膜蛋白，可參與調節機體的胚胎發育、血管形成、細胞增殖、細胞分化等，Notch1與DLL4相結合，從而將活化的Notch區域釋放出來，再將釋放出來的活化的Notch轉移至細胞核，從而對下游基因起到調控作用[14-15]。有研究顯示Notch1與DLL4在機體中存在動態平衡，可參與細胞內多種生物學活動，也可通過影響免疫細胞的數量和狀態從而影響疾病的預后[16-18]。本研究顯示重癥組與普通組的外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達水平均高于對照組，重癥組的外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表達水平均高于普通組，差異均有統計學意義（P<0.05），表明手足口病疾病發生多伴隨有DLL4/Notch信號通路激活。本研究Pearson分析顯示手足口病患兒的DLL4、Notch1與IL-6、IL-8、TNF-α存在相關性（P<0.05）。從機制上分析，隨著手足口病患兒病情的惡化，可刺激DC細胞成熟以刺激T細胞對抗病毒，可激活DLL4/Notch信號通路，從而增強炎性細胞因子表達，導致機體出現神經系統改變，使患兒病情惡化[19-21]。不過本研究也存在一定的不足，沒有進行影響因素分析，調查的小兒數量比較少，將在后續研究中進行探討。

綜上所述，手足口病患兒伴隨著DLL4/Notch信號通路相關蛋白表達的激活，可誘發大量炎癥因子的釋放，與患兒的病情存在相關性。

參考文獻

[1]秦新華，王芳，趙保玲.重組人干擾素對手足口病大鼠的治療作用及對Toll樣受體/髓樣分化因子相關信號分子的影響[J].新鄉醫學院學報，2020，37（1）：15-20.

[2]周海銀，陳艷英，隆彩霞，等.miRNA-296-5p介導PTEN/PI3K/AKT信號通路抑制神經細胞SK-N-SH中EV71病毒復制的作用機制[J].中國醫師雜志，2020，22（5）：683-688.

[3]張中馥，常海霞，李清華，等.手足口病患兒外周血中TLR4、NF-κB表達變化及意義[J].河北醫科大學學報，2019，40（8）：911-914.

[4]宋麗，楊金玲.EV71對HFMD患兒樹突狀細胞、MAPK信號通路及炎性細胞因子的影響[J].實驗與檢驗醫學，2019，37（6）：1056-1059.

[5]邱麗紅，羅文英.腸道病毒71型感染誘導宿主細胞凋亡的研究進展[J].中國醫藥生物技術，2019，14（5）：460-463.

[6]朱磊，方代華，齊共健，等.Toll樣受體在介導危重型手足口病炎性反應中的作用[J].西部醫學，2019，31（1）：87-90.

[7]朱偉金，徐翼，譚麗梅，等.腸道病毒71型阻斷RLR信號轉導通路機制研究進展[J].中華兒科雜志，2017，55（6）：475-478.

[8]李冬.EV71感染對手足口病患兒DCs成熟、凋亡及MAPK信號通路和炎性細胞因子表達的影響[J].山東醫藥，2017，57（9）：82-84.

[9]李露怡，嚴躍文，李娟，等.手足口病信號轉導和激活轉錄因子3表達研究[J].中國醫學工程，2018，26（9）：5-8.

[10]王永蓉，廉亞茹，蔣國潤，等.柯薩奇病毒A16型抗原與呼吸道黏膜上皮組織內先天淋巴細胞的相互關系及其疫苗應用價值[J].微生物與感染，2018，13（6）：350-361.

[11]白金金，龍健兒.腸道病毒71型感染誘導細胞程序性死亡形態學及分子生物學特征的初步研究[J].微生物與感染，2018，13（4）：198-206.

[12]李亞萍，翟嵩，李梅，等.TLR7基因rs3853839、rs179010多態性與EV71手足口病男性患兒易感性及病情嚴重程度相關[J].細胞與分子免疫學雜志，2017，33（7）：953-958.

[13]鄧軻，劉毅，蓋中濤.間充質干細胞對腸道病毒71型的易感性及miRNA的差異表達[J].山東大學學報（醫學版），2017，55（3）：25-31.

[14]常章梅，王玉燕，龍健兒.腸道病毒71型逃逸宿主固有免疫的分子機制[J].生命科學，2017，29（2）：179-188.

[15]高勇，徐元宏，陳曉楓，等.EV71型手足口病患兒外周血樹突狀細胞及細胞因子產生的調節機制研究[J].安徽醫科大學學報，2017，52（1）：78-82.

[16] Chen K R，Ling P.Interplays between Enterovirus A71 and the innate immune system[J].Rev Med Virol，2019，26（1）：95.

[17] Lin J Y，Kung Y A，Shih S R.Antivirals and vaccines for Enterovirus A71[J].J Biomed Sci，2019，26（1）：65.

[18] Owino C O，Chu J J H.Recent advances on the role of host factors during non-poliovirus enteroviral infections[J].Rev Med Virol，2019，26（1）：47.

[19] Rasti M.An update on enterovirus 71 infection and interferon type I response[J].Virol Sin，2019，29（1）：e2016.

[20] Wang H，Li Y.Recent Progress on Functional Genomics Research of Enterovirus 71[J].Int J Mol Sci，2019，34（1）：9-21.

[21] Xiao X，Qi J，Lei X，et al.Interactions Between Enteroviruses and the Inflammasome： New Insights Into Viral Pathogenesis[J].Front Microbiol，2019，10（3）：321.

（收稿日期：2021-03-03） （本文編輯：姬思雨）