基于譜效相關法探究酒炙丹參增強抗凝血活性的物質基礎

周 巧張智慧張學蘭王 悅甄 臻奚亞亞

（1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南250355； 2.山東省高校中藥質量控制與全產業鏈建設協同創新中心，山東 濟南250355）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰的功效［1］，是臨床上治療心腦血管疾病的大宗常用中藥。丹參中的有效成分主要包括水溶性和脂溶性兩大類，前者主要有丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶醛、丹參素等，具有抑制血管細胞動脈硬化、促血管生成、抑制血小板聚集等作用；后者主要有丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮I 等，具有抗凝血、抗血栓、抗氧化等作用［2?4］。2020 年版《中國藥典》 收載丹參和酒丹參2 種飲片規格。據古籍記載，金、明代以來酒炙成為丹參主要的炮制方法之一，且《景岳全書》 中提出“酒洗去土，晾干，切，破血生新”；《本草辨義》 中“酒炒用，畏咸水忌醋。漬酒服，能療足痹”說明古人已認識到酒丹參較強的活血化瘀、止痛作用，現代認為酒炙丹參可緩和其寒涼之性，增強活血祛瘀、調經止痛之功［5］。

中藥指紋圖譜具有整體、宏觀和模糊的特點，能最大程度地反映中藥中所含成分的種類和含量，但無法確定這些成分是否為發揮臨床作用的藥效物質，將化學指紋圖譜與生物活性評價相結合，構建譜效關系，可初步探索中藥的藥效物質［6］。PLS?DA 是一種融合了多因變量對多自變量的回歸建模以及主成分分析在內的多元數據分析方法，尤其適用于自變量間存在多重相關性以及樣本數量少于自變量數量的數據分析［7］。

研究表明，丹參酒炙后酚酸類和丹參酮類成分發生明顯的質變和量變［8?10］。丹參生品具有抑制血小板聚集、抗凝血作用，且酒炙后藥效增強［11］。目前，關于丹參的指紋圖譜已用于丹參及相關制劑的品質評價［12］。然而，丹參酒炙增效的物質基礎及炮制機理尚未闡明，缺乏具有個性特點的丹參與酒丹參飲片質量評價標準。本研究采用HPLC 法建立丹參生品與酒炙品指紋圖譜，結合體外抗凝血藥效指標數據，采用PLS?DA 法，將指紋圖譜所代表的化學信息與藥效數據所代表的生物效應信息相關聯，探討丹參酒炙增強抗凝血活性的主要貢獻成分。本研究旨在為揭示丹參炮制機理及建立丹參與酒丹參飲片質量評價標準提供科學依據。

1 材料

日立L?2000 Elite 高效液相色譜儀、L?2455 二極管陣列檢測器（日本日立公司）；FA1604N 電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；LDZ4?0.8 離心機（北京醫用離心機廠）；KQ?250E 醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MK?30 炒藥機（江陰市祝塘明科機械廠）；XL1000E 全自動凝血分析儀（北京眾馳偉業科技發展有限公司）。

丹參酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸草酸、丹參素鈉對照品（上海源葉生物科技有限公司）；隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、5?羥甲基糠醛對照品對照品（中國食品藥品檢定研究院），以上對照品純度均大于98.0%。纖維蛋白原（FIB）測試盒、活化部分凝血活酶時間（APTT）測定試劑盒、凝血酶原時間（PT）測定試劑盒、凝血酶時間（TT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

10 批生丹參飲片經山東中醫藥大學中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia?miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖的切制品，產地分別為河北（S1）、山西（S2）、四川（S3）、河南（S4）、河北（S5）、陜西（S6）、安徽（S7）、山東1（S8）、湖北（S9）、山東2（S10）。

新西蘭白兔24 只，體質量2.2～2.5 kg，購自山東魯抗醫藥股份有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（魯）20080002。

2 方法與結果

2.1 酒丹參制備 取10 批生丹參飲片各100 g，加稀黃酒20 mL（黃酒∶水＝1 ∶1），拌勻，悶潤2 h，置炒藥機內，30 r／min 炒制20 min，取出晾涼，篩去碎屑，混勻，塑料袋密封，即得，編號A1～A10。

2.2 HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取對照品丹參酮ⅡA、丹酚酸B、隱丹參酮、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮Ⅰ、丹參素鈉適量，加甲醇制成每1 mL 含丹參酮ⅡA、丹酚酸B 各130 μg，隱丹參酮、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮Ⅰ、丹參素鈉、5?羥甲基糠醛各30 μg 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取生丹參、酒丹參粉末（過3 號篩）各0.5 g，置具塞錐形瓶中，加80% 甲 醇20 mL，密 塞，稱定質 量，超 聲（250 W、40 Hz）處理40 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.05% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，90.0%～77.0% B；15～25 min，77.0%～75.0% B；25～42 min，75.0%～58.0% B；42～73 min，58.0%～27.0% B；73～82 min，27.0%～18.0% B；82～85 min，18.0%～15.0%B；85～90 min，15.0%B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長270 nm。

2.2.4 精密度試驗 取同一批生丹參，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項條件下連續進樣6 次，測定并記錄主要色譜峰的保留時間和峰面積。結果，各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩定性試驗 取同一批生丹參，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下自然放置24 h 后于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.3”項條件下進樣測定，測定并記錄主要色譜峰的保留時間和峰面積。結果，各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一批生丹參6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項條件下進樣測定，記錄主要色譜峰的保留時間和峰面積。結果，各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 圖譜生成 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在“2.2.3”項條件下分析，指紋圖譜見圖1～2。

圖1 10 批生丹參HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of raw S.milti?orrhiza

結果表明，生丹參及酒丹參HPLC 指紋圖譜存在顯著差異。丹參酒炙后，色譜峰1（丹參素鈉）、3（原兒茶醛）、8、9、10、16 的峰面積顯著增加，而色譜峰4（咖啡酸）、7（丹酚酸B）、13、15、19、20（丹參酮ⅡA）明顯降低；色譜峰a、b（5?羥甲基糠醛）在生品中未檢出，可能為酒炙后的新增峰。

圖2 10 批酒丹參HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of wine?pro?cessed S.miltiorrhiza

2.2.8 相似度分析 將各批生丹參、酒丹參指紋圖譜峰面積數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A 版”，計算各批樣品指紋圖譜的相似度。結果，10 批生丹參飲片與對照圖譜的似度度為0.991～0.999，10 批酒丹參飲片與對照圖譜的相似度為0.982～0.999。

2.3 體外抗凝血活性測定

2.3.1 供試品溶液制備 取生丹參、酒丹參粉末（過3 號篩），分別加12 倍量80%甲醇超聲提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至浸膏。取適量，加入1%二甲基亞砜超聲溶解，制成質量濃度相當于0.1 g／mL 生藥的溶液，即得。

2.3.2 APTT、PT、TT、FIB 測定

取健康新西蘭白兔，隨機分為空白對照組、生丹參組、酒丹參組，每組8 只，適應性喂養7 d，實驗前禁食8 h，耳緣靜脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉（血與抗凝劑體積比為9 ∶1）抗凝，收集于離心管中，3 000 r／min 離心15 min，吸取上清液，即得待測血漿。按各試劑盒的要求進行凝血指標（PT、APTT、TT、FIB）的測定，采用SPSS 22.0統計軟件對實驗數據進行統計處理，實驗數據以（）表示。結果見表1。

表1 生丹參、酒丹參對PT、APTT、TT、FIB 的影響（， n＝8）Tab.1 Effects of crude and wine?processed S.miltiorrhiza on PT，APTT，TT and FIB（， n＝8）

表1 生丹參、酒丹參對PT、APTT、TT、FIB 的影響（， n＝8）Tab.1 Effects of crude and wine?processed S.miltiorrhiza on PT，APTT，TT and FIB（， n＝8）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，** P＜0.01；與相應的丹參生品組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

與空白對照組比較，生丹參和酒丹參均可延長PT、APTT、TT（P＜0.05 或P＜0.01），縮短FIB（P＜0.05 或P＜0.01），表明生丹參與酒丹參均有抗凝血活性；與生丹參比較，酒丹參能延長PT、APTT、TT（P＜0.05 或P＜0.01），縮短FIB（P＜0.05 或P＜0.01），表明丹參酒炙后抗凝血活性顯著增強。

2.4 相關性分析 利用SIMCA?P14.1 軟件中的偏最小二乘回歸分析（PLS?DA），比較生丹參及酒丹參在同一質量濃度（0.1 mg／mL）下抗凝血活性與HPLC 色譜峰的相關性。以生丹參、酒丹參的共有峰面積為自變量，抗凝血指標APTT、PT、TT、FIB 為因變量，進行共有色譜峰與活性指標之間的相關性分析。變量對抗凝血活性的影響可由VIP 值的大小來衡量，20 個共有峰分別與APTT、PT、TT、FIB 指標相關的VIP 見圖3。

圖3 生丹參、酒丹參譜效相關PLS?DA 模型的VIP 圖Fig.3 VIP diagrams of spectrum?effect related PLS?DA models for crude and wine?processed S.miltiorrhiza

VIP 越大，即變量離X 軸越遠，表明該色譜峰對于丹參與酒丹參的分類貢獻越大，即為最能導致生丹參、酒丹參藥效相區分的差異成分。由圖3 可知，峰7（丹酚酸B）、6（紫草酸）、5（迷迭香酸）、15 的VIP 值均大于1，表明上述色譜峰對生丹參、酒丹參抗凝血活性差異的貢獻較大，也是導致兩者作用不同的主要成分。

3 討論

凝血過程主要分為內源性和外源性2 種凝血途徑，大致可分為凝血酶原激活物的形成、凝血酶的形成及纖維蛋白的形成3 個階段。APTT 是反應內源性凝血途徑的指標；PT 可反映外源性凝血途徑的有關因子的水平；TT 主要反映纖維蛋白原轉變為纖維蛋白的時間；FIB 即為凝血因子Ⅰ，通過對纖溶系統的影響反映凝血效果［13］。

本實驗采用HPLC 法建立了生丹參及酒丹參指紋圖譜，選取APTT、PT、TT、FIB 4 個指標測定了丹參及酒丹參的體外抗凝血活性，與生品比較，酒丹參的抗凝血作用顯著增強。用PLS?DA 法對丹參及酒丹參的共有峰與抗凝血藥效進行譜效相關分析，建立丹參生品及酒制品的共有峰與抗凝血活性藥效的相關性模型，發現導致丹參及酒丹參在抗凝血活性方面差異的主要成分包括丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸及1 種未知成分，此未知成分的結構及在活血化瘀方面的活性還需進一步驗證。該方法能夠較精準的找到導致中藥炮制前后藥理活性發生變化的物質基礎，以期為傳統醫藥理論提供佐證，為丹參及酒炙丹參的質量控制與譜效關系研究提供思路。

課題組前期研究發現，丹參經酒炙后丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸含量均降低，丹酚酸B 轉化為丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸C，迷迭香酸轉化為丹參素、咖啡酸、阿魏酸［14］。據報道，迷迭香酸在體內的代謝產物為香豆酸、丹參素等成分；丹酚酸B 在體內降解為丹參素、咖啡酸及紫草酸［15?16］，推測丹參酒炙過程中受溫度的影響促使丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸轉化為更易被人體吸收、活性更強的化合物，從而增強了其抗凝血藥效，有待深入研究。