不同鹽酸青藤堿制劑的毛細管電泳分析方法

吳紅根仇 萍彭曉珊彭祖仁李 正李文龍*

（1.天津中醫藥大學中藥制藥工程學院，天津300193； 2.省部共建組分中藥國家重點實驗室，天津300193； 3.湖南正清制藥集團股份有限公司，湖南 懷化418000）

鹽酸青藤堿是從防己科植物青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.或毛青藤Sinomenium acutum（Thn?nb.）Rehd.et Wils.var.cinereumRehd.et Wils.的干燥藤莖中提取制備的一種生物堿單體［1］，是青藤堿的鹽酸鹽形式，具有廣泛的藥理活性，在抗炎、抗免疫、抗腫瘤等方面具有顯著作用［2?4］。在治療過程中，青藤堿多種制劑聯用的效果要優于單一制劑，由湖南正清制藥集團股份有限公司提出的“正清風痛寧風濕與疼痛‘金三角’ 特色療法”對風濕類風濕性關節炎等風濕病的療效確切，該療法以正清風痛寧注射劑電致孔透皮給藥、局部注射，正清風痛寧片劑口服聯合用藥進行風濕與疼痛的治療，經國內多家醫院使用驗證具有良好的治療效果［5］。國內報道的測定鹽酸青藤堿制劑的方法多數為HPLC 法［6?12］，但該方法具有分離時間長、流動相的消耗大、易造成污染等缺點，且色譜峰不規則，存在拖尾現象。也有研究人員使用其他方法分析鹽酸青藤堿制劑，包括毛細管電泳法［13?14］、電化學法［15］、拉曼和近紅外分析方法［16］，但是這些分析鹽酸青藤堿制劑的方法往往是對單一劑型進行分析，適用范圍有限，尚未見采用毛細管電泳技術分析多種鹽酸青藤堿制劑的普適性方法報道。毛細管電泳法具有分離效率高、檢測速度快、樣品量小、操作簡便、成本低等優點，在中藥分析中有較好的應用前景。本研究建立了測定正清風痛寧片、正清風痛寧緩釋片、正清風痛寧注射液3 種制劑中鹽酸青藤堿含量的普適性毛細管電泳方法，該方法具有快速高效、綠色環保的特點，實用性較好，可用于不同劑型的鹽酸青藤堿制劑的含量測定。

1 材料

P／ACETMMDQ Plus 毛細管電泳儀，配備二極管陣列檢測器，32 Karat software 工作站（美國Beckman 公司）；未涂層石英毛細管柱（50.2 cm×50 μm，有效長度40 cm，美國Beckman 公司）；針頭式濾膜（0.22 μm，邁博瑞生物膜技術有限公司）；AE240 電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；SB?5200DTDN 型號超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；FE 20 PH 計（瑞士Mettler?Toledo公司）。

鹽酸青藤堿對照品（上海源葉生物科技有限公司）。樣品由湖南正清制藥集團股份有限公司生產，包括正清風痛寧片（每片含鹽酸青藤堿20 mg）、正清風痛寧緩釋片（每片含鹽酸青藤堿60 mg）和正清風痛寧注射液（2 mL ∶50 mg）。硼酸（天津索羅門生物科技有限公司）；Tris（北京索萊寶科技有限公司）；純水（屈臣氏商標有限公司）；氫氧化鈉（分析純，凱瑪特天津化工科技有限公司）；甲醇（色譜純，美國Fisher 公司）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸青藤堿對照品2.50 mg于10 mL 棕色量瓶中，適量純水超聲溶解，冷卻，放至室溫后定容，配制成質量濃度為0.25 mg／mL 的對照品溶液，在4 ℃下貯存備用，進樣前過0.22 μm 微孔濾膜。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 片劑 取正清風痛寧片（批號1809103）20 片，用小刀除去包衣，研磨成粉末，精密稱取32.94 mg 于25 mL量瓶中，加入適量純水超聲溶解，冷卻，待放至室溫后定容，即得質量濃度為1.317 6 mg／mL 的供試品溶液，4 ℃下貯存備用，進樣前過0.22 μm 微孔濾膜。

2.2.2 緩釋片 取正清風痛寧緩釋片（批號1809101）20片，研磨成粉末，精密稱取32.99 mg 于25 mL 量瓶中，加入適量純水超聲溶解，冷卻，放至室溫后定容，即得質量濃度為1.319 6 mg／mL 的供試品溶液，在4 ℃下貯存備用，進樣前過0.22 μm 微孔濾膜。

2.2.3 注射劑 精密量取正清風痛寧注射液（批號1806401）1 mL（相當于鹽酸青藤堿25 mg），置于25 mL量瓶中，加入適量純水稀釋超聲，冷卻，放至室溫后定容，即得質量濃度為1 mg／mL 的供試品溶液，在4 ℃下貯存備用，進樣前過0.22 μm 微孔濾膜。

2.3 電泳條件 采用未涂層石英毛細管色譜柱（50.2 cm×50 μm，有效長 度 40 cm）；緩沖液 H3BO3?Tris（0.2 mol／L）；進樣方式電動進樣；電壓10 kV；進樣時間5 s；分離電壓15 kV；在262 nm 波長下進行檢測。新的毛細管柱在首次使用時需做活化處理，分別用甲醇10 min、純水10 min、1 mol／L NaOH 20 min、純水20 min，運行緩沖液沖洗15 min。樣品運行前依次用NaOH、水、緩沖液各沖洗5 min，所有溶液進毛細管之前均經過0.22 μm 微孔濾膜過濾。電泳色譜圖見圖1。

圖1 不同樣品毛細管電泳色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密稱取鹽酸青藤堿對照品0.5 mg，按“2.1”項下方法制備質量濃度為0.5 mg／mL 的鹽酸青藤堿對照品溶液，精密量取適量，置于不同的10 mL棕色量瓶中，加純水稀釋并定容，得到鹽酸青藤堿質量濃度分別為15.625、31.25、62.5、125、250、500 mg／mL的溶液，在“2.3”項電泳條件下進行測定，記錄鹽酸青藤堿的色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為Y＝6.50×104X＋541.57（r＝0.998 8），在15.625～500 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 取同一質量濃度的鹽酸青藤堿對照品溶液，在“2.3”項條件下連續進樣6 次。結果顯示，鹽酸青藤堿峰面積和遷移時間的RSD 分別為1.82%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 精密稱取片劑粉末，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣，測得鹽酸青藤堿的峰面積和遷移時間的RSD 分別為1.34%、1.25%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取片劑粉末，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下連續進樣6 次，測得鹽酸青藤堿峰面積、遷移時間RSD 分別為1.80%、0.86%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取片劑粉末32.9 mg，平行6 份，分別加入鹽酸青藤堿質量相當于0.491 mg 的對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣，計算回收率，結果見表1。

表1 鹽酸青藤堿加樣回收率試驗（n＝6）

2.4.6 檢測限 將樣品逐級稀釋，在“2.3”項條件下計算峰面積響應值與基線噪音的強度，以S／N ＝3 為檢測限，測得結果為0.613 8 μg／mL。

2.5 樣品含量測定 取鹽酸青藤堿制劑3 種劑型各3 批，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣，計算含量和遷移時間，結果見表2。

表2 3 種鹽酸青藤堿制劑含量測定結果（n＝9）

3 討論與結論

緩沖液在毛細管電泳分析中起著決定性作用，本實驗嘗試了磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、硼砂?氫氧化鈉緩沖液、硼酸?氫氧化鈉緩沖液、硼酸?硼砂緩沖液、Tris?鹽酸緩沖液、硼酸?Tris 緩沖液。通過比較發現只有硼酸能夠將雜質峰與樣品峰分開，而且Tris 能夠有效的改善拖尾。在選定了緩沖液種類之后，對緩沖液的pH 進行優化，分別在pH 6.24、6.43、6.5、6.6、6.83 下進行試驗，發現只有在pH 6.5 的時候分離效果最佳，在這個環境下雜質峰和樣品峰能夠完全基線分離，并且基線噪音干擾最小，且峰形最美觀。電壓的大小影響出峰速度，電壓較大時出峰速度快，但易造成基線不穩，也可能使峰的分離效果不好，電壓較小時，能實現峰的分離，但易造成拖尾，本實驗在電壓分別為10、15、20 kV 的條件下進行試驗，發現在電壓為15 kV 時，峰的分離效果最好。

通過建立毛細管電泳方法，在4 min 內將鹽酸青藤堿制劑中的物質完全分離，這種方法與現有的分離鹽酸青藤堿的方法相比，明顯縮短了分析時間，并且大大減少了有毒試劑的消耗。因此，該方法簡便環保，穩定可靠，具有一定實用性，可快速鑒定鹽酸青藤堿，以期為其制劑質量的進一步研究提供參考。