16 個產地紅曲中洛伐他汀及桔霉素測定

齊方圓任 丹黃紫妍秦路平*朱 波*

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122； 2.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州310053； 3.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽712046）

紅曲是我國傳統中藥，用藥歷史悠久，是藥食兩用中藥的代表藥之一［1］。紅曲是以稻米為原料，由曲霉科真菌紫色紅曲霉Monascus purpureusWent發酵而成，臨床上用于治療高脂血癥、降低膽固醇，其主要活性成分洛伐他汀，可作為膽固醇合成途徑中3?羥基?3?甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG?CoA）還原酶的競爭性抑制劑，有效減少膽固醇的合成［2?4］。純天然發酵的紅曲產品中，洛伐他汀是以內酯式與酸式2 種形式存在［1］，內酯式洛伐他汀需體內產生的羥基酯酶水解成酸式方能發揮藥效，酸式洛伐他汀與HMG?CoA 還原酶結構更為接近，具有更強的生物活性［5］。2020 年版《中國藥典》中關于紅曲的質量標準只規定了內酯式洛伐他汀（C24H36O5）不得少于0.22%，且有的研究也僅測定了紅曲中內酯式洛伐他汀的含量［6?8］，忽略了酸式洛伐他汀的存在，因此同時測定紅曲中2 種構型洛伐他汀的含量更能反映紅曲產品的質量。此外，紅曲霉發酵過程中產生的真菌毒素桔霉素［9］，具有肝腎毒性［10］、致畸性［11］與致癌性［3，12?13］，是危及人類、動物健康的潛在威脅，在一定程度上限制了紅曲產業的發展。

目前關于同時測定紅曲中內酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀與桔霉素的研究鮮有報道，已有報道也僅針對少數產地［14］，并不能客觀地反映現有市場上紅曲產品質量優劣及安全性。綜上，本實驗收集全國紅曲主產區16 個產地紅曲樣品，以內酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、桔霉素3 種成分為指標性狀，建立HPLC?PDA／FLR 法對其進行含量測定，并分析比較其含量差異，以期為紅曲藥材的質量控制與安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 Waters Alliance e2695 型高效液相色譜儀（配置自動進樣器、柱恒溫箱、PDA 及FLR 雙檢測器，美國Waters 公司）；KQ?300DV 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2204B 型電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；超純水儀（美國Millipore 公司）；免疫親和柱（CitriTestTMHPLC，北京中檢維康技術有限公司）。洛伐他汀（B20806）、桔霉素（B25912）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；PBS 緩沖液（上海生工生物工程有限公司）。樣品信息見表1。乙腈（色譜純，美國天地公司）；磷酸（色譜純，上海阿拉丁公司），其余試劑均為分析純。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 洛伐他汀，ZORBAX Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.1%磷酸（B），梯度洗脫（1～5 min，60%～65% A；5～20 min，65% A；20～25 min，65%～90%A；25～30 min，90%～60% A；30～35 min，60%A）；柱溫28 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測波長238 nm；進樣量10 μL。桔霉素，ZORBAX Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈?水（磷酸調pH2.5）（53.5 ∶46.5）；柱溫28 ℃；體積流量1.0 mL／min；熒光檢測器（λex＝331 nm，λem＝500 nm）；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

1.2.2 線性關系考察 精密稱取洛伐他汀對照品適量，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成206.4 μg／mL 對照品溶液。精密稱取內酯式洛伐他汀對照品2 mg，適量甲醇溶解，用0.2 mol／L NaOH溶液超聲轉化40 min，取出冷卻后，用3 mol／L磷酸將pH 調至7.7，甲醇定容至10 mL 量瓶，即得208.9 μg／mL 對照品溶液［14］。精密稱取桔霉素對照品1 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，質量濃度為100 μg／mL，于4 ℃冰箱中保存備用。將各對照品溶液用甲醇進行稀釋后，在“1.2.1”項條件下進樣，以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，見表2，可知各指標成分在各自范圍內線性關系良好。各對照品溶液稀釋至不同倍數后，在“1.2.1”項條件下進樣，采用信噪比法測定各指標成分的檢測限（S／N ＝3 ∶1）、定量限（S／N ＝10 ∶1），結果見表2。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

1.2.3 樣品含量測定

1.2.3.1 洛伐他汀測定供試品溶液制備 精密稱取經充分粉碎均質紅曲粉末（紅曲米、膠囊及片劑均研磨粉碎后過5 號篩）0.5 g，置于25 mL 具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質量，超聲（300 W、40 kHz）45 min 后取出，放冷，甲醇補足減失質量，搖勻，離心（4 000 r／min）10 min，取上清液過0.45 μm 微孔有機濾膜，取續濾液，即得。

1.2.3.2 桔霉素供試品溶液制備 精密稱取均質紅曲粉末（紅曲米、膠囊及片劑均研磨粉碎后過5號篩）1.0 g，置于25 mL 具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇提取液，搖晃均勻，60 ℃恒溫提取30 min，每10 min 搖動30 s。移取1.0 mL 經槽紋濾紙過濾后的濾液，39 mL PBS 溶液稀釋、混勻，微纖維濾紙過濾，收集濾液。精密吸取該濾液10 mL，以1～2 滴／s 體積流量全部通過CitriTestTMHPLC 親和柱直至空氣流通。再加入10 mL 0.1%吐溫?20 PBS 溶液（1～2 滴／s）流經親合柱，最后加入1.0 mL 甲醇?0.1%磷酸（70 ∶30）洗脫液以1 滴／s或者更低的體積流量淋洗CitriTestTMHPLC 親和柱，收集所有樣品淋洗液（1.0 mL）于干凈容器中，備用。

1.2.4 精密度試驗 分別精密吸取質量濃度為20.02、10.45 μg／mL 的內酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀對照品溶液各10 μL，以及100 ng／mL 桔霉素對照品溶液20 μL，在“1.2.1”項條件下連續進樣測定6 次，測得內酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、桔霉素保留時間RSD 分別為0.11%、0.19%、0.96%，峰面積 RSD 分別為 1.59%、1.38%、1.80%，表明儀器精密度良好。

1.2.5 重復性試驗 精密稱取浙江SM 樣品0.5 g、福建TX 樣品1.0 g，按“1.2.3”項下方法分別平行制備6 份供試品溶液，在“1.2.1”項條件下進樣，測得內酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、桔霉素峰面積RSD 分別為1.26%、1.45%、1.63%，含量RSD 分別為1.22%、1.40%、1.67%，表明該方法重復性良好。

1.2.6 穩定性試驗 精密稱取浙江SM 樣品0.5 g、福建TX 樣品1.0 g，按“1.2.3”項下方法分別制備供試品溶液，于室溫下放置0、1、2、4、6、8 h后在“1.2.1”項條件下進樣，測得內酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、桔霉素峰面積RSD 分別為1.56%、1.26%、1.41%，表明溶液在8 h內穩定性良好。

1.2.7 加樣回收率試驗 取含量已知的杭州TJT紅曲樣品6 份，每份精密稱定0.5 g，分別加入等量的內酯式洛伐他汀對照品溶液（0.806 5 mg）和酸式洛伐他汀對照品溶液（0.864 5 mg），取含量已知的福建TX 紅曲樣品6 份，每份精密稱定1.0 g，分別加入等量的桔霉素對照品溶液（3.122 μg），按“1.2.3”項下方法分別制備測定洛伐他汀及桔霉素供試品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

1.3 數據處理與分析 應用SPSS 25.0 軟件處理數據，方差分析采用單因素ANOVA，聚類分析采用組間聯接法［15］。

2 結果

2.1 洛伐他汀含量比較 16 個產地間紅曲中洛伐他汀含量存在統計學差異（P＜0.01），見表4，內酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、總洛伐他汀平均質量分數分別為6.790、1.464、8.254 mg／g。2020年版《中國藥典》 紅曲質量標準規定，含內酯式洛伐他汀不得少于0.22%，本實驗16 批樣品中7個產地（浙江建德、浙江寧波、浙江江山、山東濱州、成都高新、北京中關村和北京懷柔）符合質量標準，其中浙江寧波產最高，達（32.611±0.047）mg／g；其他產地（如浙江杭州、浙江麗水、福建古田、福建南平、福建南平、湖北武漢、云南昆明、臺灣嘉義）樣品以內酯式洛伐他汀含量計，不符合藥典標準。

表4 各成分含量測定結果（， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n＝3）

表4 各成分含量測定結果（， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n＝3）

注：**P＜0.01。

2.2 桔霉素含量比較 16 個產地間紅曲中桔霉素含量存在統計學差異（P＜0.01），見表4，平均質量分數為4.895 μg／g。關于桔霉素的限量標準，我國相關規定有所不同，如《中國藥典》 紅曲質量標準下無桔霉素，而由國家衛生和計劃生育委員會與國家食品藥品監督管理總局共同發布的國家標準（GB 5009.222?2016）［16］中規定，桔霉素定量限為80 μg／kg。表4 顯示，本實驗16 批樣品中部分產地（如浙江建德、浙江麗水、浙江杭州，福建南平、成都高新）均未檢測出桔霉素，安全性相對較好，而大多數產品，尤其是福建屏南所產紅曲桔霉素含量最高，達（21.854±0.176）μg／g，不符合上述標準。

2.3 聚類分析 以內酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀和總洛伐他汀含量為參考指標，對各批樣品進行聚類分析，根據歐氏距離D2＝13.12 將不同產地劃分為4 個類群，見圖2。類群Ⅰ共10 個產地，分別為云南昆明、臺灣嘉義、福建古田1、福建南平、福建屏南、福建古田2、湖北武漢、浙江杭州、北京懷柔、浙江麗水，該類群內酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀與總洛伐他汀含量均較低；類群Ⅱ共2 個產地，分別為山東濱州、北京中關村，該類群內酯式洛伐他汀與總洛伐他汀含量較高，但酸式洛伐他汀含量較低；類群Ⅲ為2 個產地，分別為浙江建德、成都高新，該類群內酯式洛伐他汀與總洛伐他汀含量均較高，酸式洛伐他汀含量在所有產地中偏高；類群Ⅳ中2 個產地分別為浙江寧波、浙江江山，兩者內酯式洛伐他汀、總洛伐他汀含量在所有產地中偏高，酸式洛伐他汀含量較高。

圖2 16 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of sixteen batches of samples

3 討論與結論

本實驗用PDA 檢測器對內酯式及酸式洛伐他汀對照品溶液在210～400 nm 波長范圍下進行掃描，結果表明，酸式和內酯式洛伐他汀對照品溶液的最大吸收波長均為238.2 nm。測定洛伐他汀考察了流動相（甲醇?水、乙腈?水、甲醇?0.1%磷酸、乙腈?0.1% 磷酸）、提取溶劑（75% 乙醇、甲醇、乙腈）、超聲時間（30、45、60 min）對紅曲中洛伐他汀含量的影響，發現在乙腈?0.1%磷酸系統下基線相對平穩，峰形相對尖銳，各峰之間分離度良好，甲醇與乙腈的提取效果相對75% 乙醇較好，但兩者之間無明顯差別，超聲45 min 即可提取完全，故選擇以乙腈?0.1%磷酸為流動相，甲醇提取超聲45 min。測定桔霉素考察了流動相乙腈?水（磷酸調pH 2.5）比例（60 ∶40、53.5 ∶46.5、50 ∶50、40 ∶60）對桔霉素色譜峰的影響，發現在比例53.5 ∶46.5 條件下，桔霉素保留時間為8.036 min 適宜，與溶劑峰之間能夠較好地分離，各峰之間分離度良好。

目前，常用的桔霉素檢測方法主要有HPLC法、酶聯免疫吸附法和高效毛細管電泳法等，這些方法均需復雜的樣品前處理步驟，過程復雜、耗時長，且難以進行痕量檢測［17］。本實驗采用免疫親和柱處理的方法直接對紅曲中的桔霉素進行富集凈化，利用柱內桔霉素的高度特異性抗體吸附，快速特異地將桔霉素從樣品中分離出來，并同時完成凈化和濃縮步驟，速度快，操作簡單，準確性高。

本實驗所測16 個產地紅曲產品質量存在差異，以浙江產紅曲質量較好，而其他產地如福建、云南、臺灣等地所產紅曲質量次之，這可能是由于各產地紅曲菌種、制備條件以及生產加工方式差別而造成的。下一步將利用同一菌種以同一制備條件和生產加工方式在不同產地環境下制備紅曲，比較其有效成分含量差異，探索不同產地環境下穩定高產優質紅曲的制備工藝，以期為紅曲產業發展提供依據。