食源性病原菌的富集與檢測(cè)復(fù)合技術(shù)研究進(jìn)展

王俊韻，沈靜雯，陸利霞, ，盧一辰，劉元鍵，熊曉輝,

（1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 211816；2.國家輕工業(yè)食品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)南京站，江蘇南京 211816）

食源性病原菌是可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細(xì)菌，能夠入侵宿主并產(chǎn)生致病性。常見的食源性病原菌有痢疾桿菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、結(jié)核菌、豬丹毒桿菌等。世界衛(wèi)生組織宣布，每年食物中毒約數(shù)十億人。美國疾控中心報(bào)告稱[1]，美國每年有4800萬例食源性疾病。在中國，食品安全面臨的最大威脅也是食源性病原體污染。據(jù)報(bào)道[2]，2015年中國有3181例食源性病原體中毒，占總食物中毒病例的53.7%。一般情形下，食品中病原菌的濃度偏低，傳統(tǒng)的食源性病原菌檢測(cè)需要進(jìn)行增菌、分離、鑒定等多個(gè)步驟，約4～7 d，在實(shí)踐中具有一定的局限性[3]。目前常用的食源性致病菌快速檢測(cè)方法包括電化學(xué)生物傳感器[4]、PCR技術(shù)[5]、免疫層析技術(shù)、DNA探針技術(shù)[6]等。即使經(jīng)過選擇性增菌培養(yǎng)后，致病菌的快速檢測(cè)仍然受到培養(yǎng)基成分、食品成分等影響。因此為了減少和避免干擾成分，需要采用有效的菌體分離及富集技術(shù)。

磁珠分離富集技術(shù)因富集量大且富集時(shí)間短而受到廣泛關(guān)注。磁珠表面可針對(duì)不同目標(biāo)菌而進(jìn)行特定修飾，將病原菌特異性吸附于磁珠表面。但磁珠尺寸分布不均勻且缺乏長期穩(wěn)定性[7]，并受食品基質(zhì)的影響較大，在實(shí)際應(yīng)用中存在局限性。復(fù)合病原菌富集與檢測(cè)一體的電泳技術(shù)，將電泳分離和免疫反應(yīng)相結(jié)合，使分辨率達(dá)到微量、超微量（1～0.001 ng）水平，更好地應(yīng)用于微生物分析領(lǐng)域。隨著電子芯片的發(fā)展，微流控技術(shù)成為熱點(diǎn)[8]。將樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等縮微到一個(gè)幾平方厘米的芯片上，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的在線實(shí)時(shí)分析[9]。本文對(duì)食品中病原菌的富集與分離技術(shù)進(jìn)行了綜述，分析了不同富集及檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為食源性病原菌快速檢測(cè)的開發(fā)提供參考。

1 磁珠富集技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，是將免疫學(xué)的高度特異性與磁珠特有的磁性相結(jié)合而發(fā)展出來的一種新技術(shù)。利用包被于磁珠表面的抗體與樣品中的目標(biāo)物結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。在外加磁場的作用下，標(biāo)記復(fù)合物的磁珠進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng)，使樣品中的目標(biāo)物與雜質(zhì)分離，達(dá)到富集、純化、濃縮目標(biāo)物的目的。

在磁珠富集技術(shù)中，磁珠的粒徑、均一性、磁響應(yīng)強(qiáng)度、分散性等性質(zhì)決定了磁珠對(duì)病原菌的富集與分離速度。磁珠粒徑影響其在樣品中的穩(wěn)定性。通常，粒徑1 μm以上的磁珠，在樣品中沉降速度較快，不具備懸浮的穩(wěn)定性，因此對(duì)病原菌的吸附并不理想。未進(jìn)行表面修飾的磁珠為裸磁珠，能夠吸附基質(zhì)中的各類不同菌種；而功能化磁珠是在裸磁珠的表面進(jìn)行官能團(tuán)修飾，表面修飾成分對(duì)特異性吸附影響顯著，可增強(qiáng)對(duì)特定致病菌的富集能力，提高目標(biāo)菌體濃度，減少雜菌干擾。均一穩(wěn)定的表面修飾使磁珠產(chǎn)生最大的表面吸附能力，使病原菌與修飾的識(shí)別體間結(jié)合更加牢固。

1.1 裸磁珠富集法

未經(jīng)抗體包被的超順性Fe3O4粒子即為裸磁珠。超順磁性顆粒的尺寸通常在納米到微米之間，可應(yīng)用于分子成像、藥物傳遞、臨床診斷或食品安全等諸多領(lǐng)域[10]。裸磁珠的制備已較為成熟，可通過共沉淀法、溶劑熱法、乳液聚合法等方法制備。

吳俊等[11]研究表明濃度為102～107CFU/mL的金黃色葡萄球菌，裸磁珠在10 min之內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行富集，且吸附率達(dá)到95%以上；在金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的混合菌體中，裸磁珠對(duì)金黃色葡萄球菌的吸附占優(yōu)勢(shì)，可達(dá)到86%左右。也對(duì)牛肉樣品中金黃色葡萄球菌富集進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，吸附濃度為102CFU/mL，吸附率降為80%～87.27%，但仍可滿足PCR法檢測(cè)要求，為實(shí)際樣品中裸磁珠富集金黃色葡萄球菌以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)提供了參考。邱晉等[12]在37 ℃利用裸磁珠對(duì)常見的食源性病原菌（蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌等）進(jìn)行吸附，其吸附率均高于97%，即使存在食品基質(zhì)的影響，裸磁珠的最低吸附率仍為58.42%。裸磁珠較強(qiáng)的吸附性，能夠?qū)κ称分械亩喾N病原菌進(jìn)行非特異性富集，經(jīng)富集的菌體在后續(xù)的培養(yǎng)和檢測(cè)中可減少食品基質(zhì)對(duì)其干擾。

由于裸磁珠不具有特異性吸附的特點(diǎn)，因此適用于判斷樣品中微生物區(qū)系差異。當(dāng)食源性疾病爆發(fā)時(shí)，可用裸磁珠富集樣品中所有類型的病原菌，避免特異性分離導(dǎo)致的漏檢。由于裸磁珠的吸附性能極易受到環(huán)境的影響，如食品中的固體顆粒、過量鹽離子、過量的酸堿度等多種因素，使其難以有效捕獲和檢測(cè)樣品中的微量病原菌，增加了在實(shí)際應(yīng)用中出現(xiàn)假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)[13]。

1.2 功能化磁珠富集法

裸磁珠由于各向異性的偶極距作用容易產(chǎn)生團(tuán)聚，無法形成穩(wěn)定的分散體系。因此，對(duì)磁珠表面加以修飾對(duì)減少團(tuán)聚，增強(qiáng)生物相容性及提高分散性有重要的意義[14]。磁珠具有較大的表面積-體積比，利于高效功能化[15]。免疫磁珠作為功能化磁珠中的一類，通常分為兩種結(jié)構(gòu)：核-殼式與殼-核-殼式，其中核為磁性材料，殼為無機(jī)材料或高分子材料。殼材料的加入能夠保護(hù)磁珠不受環(huán)境的影響，且官能團(tuán)的存在便于對(duì)磁性聚合物進(jìn)行修飾，提高病原菌的特異性吸附效率[16]。常見的無機(jī)材料有TiO2、SiO2等，高分子材料有多糖、聚氯乙烯、氫化肼[17]、聚乙烯醇等，其中聚苯乙烯由于其表面具有較多的活性官能團(tuán)，易于表面修飾，是較理想的骨架結(jié)構(gòu)。這些高分子材料的表面通常存在官能團(tuán)（-NH、-COOH、-OH等）以便與生物活性蛋白（抗體、核酸適配體、噬菌體等）進(jìn)行偶聯(lián)，對(duì)病原菌起到吸附作用。經(jīng)功能化磁珠富集后目標(biāo)菌的檢出限如表1所示。

1.2.1 無機(jī)材料修飾法 無機(jī)材料修飾法即在磁珠表面通過共價(jià)或非共價(jià)的形式包覆上無機(jī)材料，以提供羧基、氨基等官能團(tuán)。在外加磁場的作用下，致病菌能夠與這些官能團(tuán)偶連而達(dá)到富集的效果。Zhan等[18]制備了Fe3O4-SiO2-NH2納米顆粒，氨基作為普適基團(tuán)，可捕獲各種細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌和枯草桿菌，對(duì)這些目標(biāo)菌的吸附率分別為93.40%、90.08%、90.14%、97.39%。以制備好的氨基化納米磁珠進(jìn)行富集，對(duì)大腸桿菌O157:H7的非特異性去除率達(dá)97.39%以上，而Fe3O4-SiO2顆粒的非特異性去除率僅為29.8%。由此可見，對(duì)磁珠進(jìn)行修飾是對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行有效富集的重要手段。王聘等[27]在磁珠表面以羧基（-COOH）修飾，以此來吸附食品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、阪崎克羅諾桿菌，并進(jìn)行PCR檢測(cè)。研究了不同濃度混合菌液在模擬食品中磁珠的吸附性能。在果汁中，磁珠對(duì)目標(biāo)菌的捕獲率在57%～66%；奶粉中，磁珠對(duì)目標(biāo)菌的捕獲率在40%～54%；鴨肉中，磁珠對(duì)目標(biāo)菌的捕獲率在44%～64%。最后通過PCR檢測(cè)表明，羧基化磁珠在不同濃度的菌液、單一菌株或混合菌株的環(huán)境下，都可對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行有效富集，滿足對(duì)后續(xù)PCR的檢測(cè)需求。

表1 功能化磁珠富集致病菌及檢出限Table 1 Enrichment and detection limit of pathogenic bacteria by functional magnetic beads

無機(jī)材料范圍較廣，易于獲取。但修飾的無機(jī)材料厚度和形態(tài)（無孔、微孔等）等都會(huì)影響到富集性能。因此，尋找富集時(shí)間短、富集量大，富集干擾物少的無機(jī)材料種類和包覆條件尤為重要。

1.2.2 抗體修飾法 抗體修飾法即是在磁珠表面修飾抗體，在外加磁場的作用下通過抗原-抗體結(jié)合達(dá)到富集效果。李倩倩等[28]將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的三種抗體均修飾于Fe3O4-SiO2磁珠表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種病原菌的同時(shí)富集，并將此功能化磁珠與裸磁珠的吸附性能進(jìn)行比較。洗滌優(yōu)化后的結(jié)果表明功能化磁珠對(duì)目標(biāo)菌的平均吸附率為93.67%，對(duì)非目標(biāo)菌的吸附率為16.67%；而裸磁珠對(duì)目標(biāo)菌及非目標(biāo)菌的吸附率都低至13.33%。由此可見，功能化磁珠不僅可以提高目標(biāo)菌的富集效率，還可降低對(duì)非目標(biāo)菌體的富集。Kim等[19]研究了一種用于食源性沙門氏菌分子分析的微量全分析系統(tǒng)，使用抗體修飾磁珠對(duì)磷酸鹽溶液(PBS)和牛奶樣本中的病原菌進(jìn)行富集，從DNA提取到檢測(cè)，整個(gè)過程在30 min內(nèi)全自動(dòng)完成。在PBS和牛奶樣品中的檢出限分別為10 CFU/mL和102CFU/mL。Agrawal等[20]將抗體修飾的磁性納米顆粒嵌入于用永磁體的圓形微流控聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片中，從而使磁珠可在有限空間內(nèi)捕獲抗原，增強(qiáng)熒光信號(hào)，便于檢測(cè)。多路微流控芯片可以同時(shí)對(duì)水中的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行可視化檢測(cè)和定量。采用磁珠預(yù)濃縮技術(shù)在微通道中檢測(cè)大腸桿菌和鼠傷寒桿菌的細(xì)胞密度在103～107CFU/mL之間。這項(xiàng)研究開啟了使用微通道進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)的可能性，使之用于篩選多種臨床、水、食品和環(huán)境樣本中的多種微生物。

1.2.3 適配體修飾法 DNA和RNA適配體作為抗體的潛在競爭方法已被廣泛研究，用于包括食品安全檢測(cè)在內(nèi)的各種應(yīng)用領(lǐng)域[29]。Raghavendra Joshi等[21]采用SELEX方案獲得了針對(duì)鼠傷寒菌外膜制劑的適配體。將DNA適配體與磁珠結(jié)合，在糞便基質(zhì)中捕獲鼠傷寒桿菌，進(jìn)而采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)，可得到目標(biāo)菌的檢出限為10 CFU/g。并且即使是在極低濃度（101～102CFU/mL）時(shí)，此方法富集的目標(biāo)菌也可在PCR中檢出。

在磷酸鹽緩沖鹽水或其他原始緩沖液中對(duì)食源性致病菌的超靈敏檢測(cè)顯示[30]，病原菌經(jīng)帶有核酸適配體的磁珠富集后，通過適配體-量子點(diǎn)夾心檢測(cè)，檢測(cè)限均可達(dá)到100 CFU/mL。但目前實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差，食品中的不同基質(zhì)可能會(huì)使熒光強(qiáng)度顯著降低甚至完全猝滅，導(dǎo)致檢測(cè)失敗。Abbaspour等[31]研究構(gòu)建了一種新型的磁性生物傳感器用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，采用微量磁珠（Fe3O4）與單鏈DNA相結(jié)合，通過靜電吸引提高捕獲元件在工作電極上的吸附能力。因此，當(dāng)夾心元件均為單鏈DNA或適配體時(shí)，由于適配體在納米材料上的固定具有比抗體更好的穩(wěn)定性，且吸附目標(biāo)物的特性優(yōu)于抗體。目前，適配體和抗體同時(shí)修飾于磁珠表面用于對(duì)病原菌的富集還有待研究，Abbaspour等[31]認(rèn)為將適配體與抗體混合使用在未來的研究中或許會(huì)帶來令人驚喜的成果。

1.2.4 噬菌體修飾法 噬菌體修飾磁珠為控制和檢測(cè)有害生物提供新手段[32]。噬菌體由于較強(qiáng)的穩(wěn)定性，易溶解、易與抗原結(jié)合、免疫原性低的特點(diǎn)而備受關(guān)注。噬菌體能在裂解后期產(chǎn)生內(nèi)溶酶素，內(nèi)溶酶素能夠作用于細(xì)菌的肽聚糖層，通過高特異性來檢測(cè)和鑒定細(xì)菌[33]。Liu等[22]研究了以牛血清白蛋白為模板的Co3O4磁性納米酶（Co3O4MNE）與一種新的特異性融合噬菌體蛋白和電泳層析法結(jié)合起來檢測(cè)金黃色葡萄球菌的特異和靈敏的比色分析方法。Co3O4MNE與金黃色葡萄球菌特異性融合蛋白pVIII偶聯(lián)（Co3O4MNE@Fusion-pVIII），所制備的三功能Co3O4MNE@Fusion-pVIII顆粒能夠捕獲牛奶中的金黃色葡萄球菌，并將其從牛奶中分離富集出來。將帶有金黃色葡萄球菌的磁珠轉(zhuǎn)移至96孔板上進(jìn)行顯色。該方法的檢出限為8 CFU/mL，此方法對(duì)牛奶中濃度為10～10000 CFU/mL的金黃色葡萄球菌均可檢出。

Wang等[23]將T7噬菌體的頭部與生物素受體蛋白結(jié)合，使噬菌體顆粒定向固定在鏈霉素磁珠上，研制的T7標(biāo)記磁珠在20 min內(nèi)從肉湯中大腸桿菌吸附率為86.2%，用PCR檢測(cè)細(xì)菌16S rRNA時(shí)，檢出限約為100 CFU/mL。但噬菌體極具感染性，如何避免噬菌體的大量繁殖還需要進(jìn)一步的研究。

1.2.5 其他修飾法 目前，越來越多的生物識(shí)別分子：鏈霉親和素、多肽、溶解酶、甘露糖等都可用于高效捕獲病原菌。

鏈霉親和素作為高度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，可抵抗蛋白酶消化、極端pH和溫度，其非特異性吸附極低。報(bào)道表明[34]，聚乙二醇的存在更能進(jìn)一步抑制鏈霉親和素的非特異性吸附，這極其有利于對(duì)目標(biāo)菌的特異性吸附，減少雜菌干擾。在生物傳感器的構(gòu)建中，由鏈霉親和素包覆的磁珠可作為信號(hào)放大劑用于電化學(xué)研究中。Wang等[24]提供了用于檢測(cè)碎牛肉中大腸桿菌O157:H7的電化學(xué)阻抗譜生物傳感器。研究者將大腸桿菌抗體與大腸桿菌混合。并將用鏈霉親和素包被的納米棒倒入兩個(gè)獨(dú)立的試管中，將大腸桿菌樣品加入其中一個(gè)試管中，混合后，用磁力分離。在1 h內(nèi)，用阻抗傳感器測(cè)得大腸桿菌O157:H7的檢出限達(dá)到了104.45CFU/mL，線性范圍為104～107CFU/mL。

多肽對(duì)不同細(xì)菌的捕獲能力突出了其微生物識(shí)別的潛力，主要是因?yàn)槎嚯钠毡榫哂谢钚院蛢?nèi)在穩(wěn)定性。Magainin I是非洲爪蛙皮膚上自然產(chǎn)生的短序列肽之一，它可以選擇性地與大腸桿菌O157:H7結(jié)合。并且，這種肽對(duì)其他革蘭氏陰性菌也有廣譜親和力。盡管肽在細(xì)菌捕獲方面的潛力已被證明，但這些生物分子的主要缺點(diǎn)是非特異性或半選擇性結(jié)合，因此限制了多肽在特異性識(shí)別時(shí)的作用[35]。

溶解酶作為一種堿性蛋白質(zhì)，由吞噬細(xì)胞所分泌，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌更為敏感。Yi等[25]在磁珠表面結(jié)合了溶解酶，將金黃色葡萄球菌從樣品中分離出來。通過金黃色葡萄球菌裂解，胞內(nèi)氧化氫酶溢出與底物作用，由熒光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，在磷酸鹽緩沖液中檢出限為78 CFU/mL，總的檢測(cè)時(shí)間不超過50 min。

甘露糖結(jié)合凝集素被認(rèn)為是宿主體內(nèi)的第一道防御機(jī)制，它通過與90多種不同的細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒的表面表達(dá)的末端甘露糖和巖藻糖殘基結(jié)合而形成[36]。研究者利用這種自然現(xiàn)象對(duì)病原菌進(jìn)行富集和鎖定。Cooper等[36]利用重組甘露糖結(jié)合凝集素改性磁珠進(jìn)行富集白色念珠菌，通過微流控平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，并在3 h內(nèi)完成檢測(cè)，該裝置組合體現(xiàn)了極高的靈敏度（1 CFU/mL）。

1.3 磁珠富集法的比較

磁珠富集技術(shù)因其富集效率高，可重復(fù)性好，操作簡便，不破壞目標(biāo)物的生物性狀和功能而廣受關(guān)注[37]。裸磁珠不具有特異性及選擇性，因此對(duì)所有菌株都具有富集作用，與功能化磁珠比較，裸磁珠的吸附率稍低。在目標(biāo)致病菌濃度較高的條件下，可用裸磁珠對(duì)致病菌進(jìn)行富集，減少磁珠表面的修飾過程，方便快捷。免疫磁珠是富集病原菌的有力手段，通常在pH為中性[38]的樣品中先進(jìn)行30 min免疫反應(yīng)，再進(jìn)行3 min磁分離即可達(dá)到較為理想的富集效果，其吸附效率>80%，特異性>90%，敏感性可在10～14 CFU/mL[39]。但是，免疫磁珠富集技術(shù)也存在一定的局限性，如果偶聯(lián)在免疫磁珠上的生物識(shí)別配體不具有較強(qiáng)的特異性，則會(huì)吸附較多雜菌，且雜菌可能會(huì)抑制目標(biāo)物的生長，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

采用磁珠富集法獲得的致病菌，需要進(jìn)一步采用PCR[5?40]、生物傳感器[41?43]、免疫層析檢測(cè)[44]等方法進(jìn)行鑒別檢測(cè)，確定具體的致病菌濃度及種類。因此，在實(shí)際操作中，往往會(huì)將功能化磁珠與多種檢測(cè)手段相結(jié)合。磁珠富集可避免后續(xù)檢測(cè)過程中再受培養(yǎng)基成分的干擾，提高檢測(cè)靈敏度，縮短檢測(cè)時(shí)間。

2 富集與檢測(cè)復(fù)合技術(shù)

食源性致病菌的富集與檢測(cè)復(fù)合技術(shù)報(bào)道見表2。

2.1 電泳技術(shù)

2.1.1 毛細(xì)管凝膠電泳 毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道，高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的液相分離技術(shù)，是將柱富集與毛細(xì)管分離相結(jié)合的技術(shù)。在直流電場的作用下，帶電粒子向著與之電性相反的電極方向移動(dòng)。由于帶電粒子在電場中的游動(dòng)速度不同，可以將組分分離為不同的狹小區(qū)帶，從而達(dá)到對(duì)目標(biāo)物分離和富集的目的。GAO等[45]將含有特異性抗體的乳液與毛細(xì)管電泳相結(jié)合，在細(xì)菌樣品中快速分離出金黃色葡萄球菌，檢出限為9×105CFU/mL。此外，毛細(xì)凝膠電泳適用于區(qū)分生理形態(tài)特性相近的病原菌。陳萍等[46]利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳并配合超聲波處理快速分離出大腸桿菌的3種亞型：E.coliK88、K99和987P。何玲等[47]將毛細(xì)管電泳結(jié)合PCR和熒光檢測(cè)技術(shù)，對(duì)3種病原菌（單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌）進(jìn)行了檢測(cè)。其在提取細(xì)菌DNA后，分別對(duì)單增李斯特菌的hly基因，芽孢桿菌的16S-23SITS和金黃色葡萄球菌的nuc進(jìn)行擴(kuò)增，以膠篩分毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離，后用多重PCR進(jìn)行檢測(cè)。研究表明，在20 min內(nèi)即可完成對(duì)三種病原菌的同時(shí)檢測(cè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%～1.58%。為食品中快速檢測(cè)病原菌提供了基礎(chǔ)。

表2 食源性致病菌富集與檢測(cè)復(fù)合技術(shù)的比較Table 2 Comparison of different composite techniques in enrichment and detection for food borne pathogen

毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)于目標(biāo)目病原菌的分離快速高效，可在幾秒至幾十分鐘內(nèi)完成分離，且所需樣本量較少；但是在靈敏度和結(jié)果重現(xiàn)性方面仍需改進(jìn)。

2.1.2 介電電泳 由電泳發(fā)展而來的介電電泳技術(shù)從本質(zhì)上來說，是基于Max-well經(jīng)典電磁場理論的技術(shù)。其原理是中性粒子在非均勻電場中受到電場力而進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。中性粒子在介電液中由于受到非均勻電場的作用，產(chǎn)生不同的極化率。中性粒子表面的離子基團(tuán)與介電液中的正負(fù)電荷會(huì)向粒子與介電液的交界面運(yùn)動(dòng)，使得正、負(fù)電荷聚于交界面兩側(cè)[48]。胡沖等[49]將介電電泳結(jié)合熒光納米顆粒和微流控技術(shù)，對(duì)沙門氏菌進(jìn)行了富集，在實(shí)際樣品中沙門氏菌的檢測(cè)限為56 CFU/mL，并且檢測(cè)時(shí)間為40 min。Yang等[50]研究了沙門氏菌的免疫捕獲率，在無介電電泳時(shí)，沙門氏菌的免疫捕獲率為17.6%；而加入介電電泳的情況下，免疫捕獲率提升至64.0%。

隨著電泳技術(shù)的不斷發(fā)展，采用介電電泳阻抗技術(shù)（DEPIM）來捕獲和檢測(cè)病原菌成為更好的選擇。通過改變懸浮液的電導(dǎo)率和電場頻率，介電電泳阻抗的變化反映了被富集病原菌的數(shù)量[51]。Wang等[52]將正介電電泳與阻抗檢測(cè)相結(jié)合，形成自組裝的微系統(tǒng)裝置對(duì)大腸桿菌O157:H7進(jìn)行富集并檢測(cè)，檢測(cè)限為5×104CFU/mL，且總的檢測(cè)時(shí)間為6 min。

梯度絕緣介電電泳(g-iDEP）可檢測(cè)病原菌濃度[53]。g-iDEP設(shè)備的鋸齒設(shè)計(jì)能夠選擇性地捕獲通道中不同位置的各種生物病原菌，基于局部電場強(qiáng)度測(cè)量的電動(dòng)特性能夠分離單一物種的相似菌株。Paul等[54]根據(jù)g-iDEP的電動(dòng)特性對(duì)三種大腸桿菌相似菌株（O157:H7, O55:H7, O6:K1:H1）進(jìn)行分離，并使用適當(dāng)?shù)碾娢粭l件進(jìn)行濃縮、檢測(cè)。細(xì)菌暴露于磁場后仍能存活，這是由細(xì)胞運(yùn)動(dòng)所決定的。這些結(jié)果表明，潛在的g-iDEP在分離能力和診斷應(yīng)用的可能性方面都具有潛力。

2.2 微流控技術(shù)

微流控技術(shù)是一門多學(xué)科交叉的新興技術(shù)，涉及了物理學(xué)、數(shù)學(xué)、微加工學(xué)、工程學(xué)等。它是將生物、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室等基本功能如樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等縮微到一個(gè)幾平方厘米的芯片上，由微通道形成的網(wǎng)絡(luò)，能夠在微納米尺寸空間中對(duì)流體進(jìn)行精確操控[55]，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的在線實(shí)時(shí)分析。微流控技術(shù)由于其高度的集成化和微型化，對(duì)微生物病原菌的檢測(cè)提供了新的思路。Yonghee Kim等[56]結(jié)合3D打印技術(shù)制備微流控平臺(tái)，首次將磁珠分離與DNA純化技術(shù)集成與同一設(shè)備中，通過對(duì)樣品流速的控制，極大的縮短了富集時(shí)間，提高了富集效率。微流控技術(shù)的迅速發(fā)展，微流控元件自組裝的靈活性，使微流控這一技術(shù)成為快速富集和檢測(cè)病原菌的新手段。

2.2.1 光學(xué)檢測(cè) LI等[57]基于激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)微流控芯片系統(tǒng)，應(yīng)用于四重PCR分析的產(chǎn)物中，對(duì)副溶血性弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和志賀氏菌進(jìn)行檢測(cè)，4種病原菌均可檢出102CFU/mL。遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～2.1%。本方法也可用于人工接種食品樣品中致病菌多重PCR產(chǎn)物的快速分析。Kim等[58]將抗體“三明治”方法應(yīng)用于微流控技術(shù)，將沙門氏菌的多克隆抗體共價(jià)固定在量子點(diǎn)上，將第二多克隆抗體連接到超順磁粒子上，用永磁體和便攜式熒光計(jì)來測(cè)量附著在沙門氏菌上的量子點(diǎn)納米顆粒的熒光信號(hào)，以此判斷沙門氏菌的含量。此方法在硼酸緩沖鹽和雞精中對(duì)沙門氏菌的檢出限均為103CFU/mL。

2.2.2 電化學(xué)檢測(cè) 與光學(xué)檢測(cè)相比，電化學(xué)的優(yōu)勢(shì)不僅在于其固有的微型化和可移植性，而且還在于其檢測(cè)時(shí)不受樣品渾濁度的影響、極低的成本、低功耗以及與微加工技術(shù)的兼容性[59]。Altintas等[60]組裝了一種全自動(dòng)微流體電化學(xué)生物傳感器，采用納米修飾的免疫測(cè)定法對(duì)10～3.97×107CFU/mL范圍內(nèi)的大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為50 CFU /mL。將建立的方法應(yīng)用于納米材料修飾的水樣中大腸桿菌的定量分析。在實(shí)際樣品分析中，大腸桿菌的檢出限相同，但傳感器信號(hào)略有下降。傳感器表面可多次再生，大大降低了系統(tǒng)成本。Qi等[61]將電化學(xué)阻抗分析、脲酶催化與微流體相結(jié)合，通過磁珠-李斯特氏菌-納米金-脲酶三明治復(fù)合物捕獲李斯特氏菌，再通過微流控檢測(cè)芯片的互相交叉微電極阻抗測(cè)量來確定李斯特氏菌的數(shù)量。在30 min內(nèi)，對(duì)李斯特氏菌的捕獲效率達(dá)到了93%；在1 h內(nèi)，對(duì)李斯特氏菌的檢出限為1.6×102CFU/mL；在生菜樣品中，回收率為82.1%～89.6%。

微流控技術(shù)由計(jì)算機(jī)、數(shù)學(xué)、化學(xué)等多學(xué)科交叉應(yīng)運(yùn)而生，在微平臺(tái)上靈活組合和大規(guī)模合成實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌自動(dòng)、實(shí)時(shí)、在線的富集和檢測(cè)[62]，微流控芯片顯著優(yōu)點(diǎn)是多單元技術(shù)（包括樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)）在微平臺(tái)上的靈活組合和大規(guī)模集成。與傳統(tǒng)方法相比，微流控芯片具有小型化、高通量、集成化、低功耗，攜帶方便、檢測(cè)速度快、便于現(xiàn)場診斷等優(yōu)點(diǎn)。但是微流控技術(shù)是一門多學(xué)科交叉的技術(shù)，需要多方面的技術(shù)結(jié)合。目前，微流控技術(shù)的應(yīng)用還屬于一個(gè)起步階段，如何將多項(xiàng)操作驟集成于同一芯片上，仍是需要突破的關(guān)鍵難點(diǎn)。

2.3 復(fù)合檢測(cè)方法比較

免疫磁珠分離和電泳技術(shù)作為單獨(dú)技術(shù)，無法實(shí)現(xiàn)病原菌富集與檢測(cè)效果的最大化；而微流控技術(shù)具有的自組裝特點(diǎn)，可將這些技術(shù)進(jìn)行偶聯(lián)，獲得富集與檢測(cè)效率最優(yōu)的方案。通過富集與鑒定檢測(cè)的復(fù)合，一方面提高了對(duì)致病菌的檢測(cè)限，同時(shí)能夠縮短檢測(cè)時(shí)間、提高靈敏度，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)。

Thaitrong等[63]創(chuàng)建了微流控夾心ELISA用于快速檢測(cè)病原菌，微流控濃縮器采用微通道制備，所有反應(yīng)均在微流控通道中，借助毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)反應(yīng)物流動(dòng)實(shí)現(xiàn)富集與檢測(cè)。該微流控系統(tǒng)速度更快、便攜、更節(jié)能，且不受樣品污染，為病原菌的富集與檢測(cè)提供了新的選擇。而將磁分離與微流控技術(shù)結(jié)合時(shí)，特異性和敏感性更高，速度更快，操作更簡便。Kanayeva等[64]將磁性納米顆粒、微流控芯片和交叉微電極結(jié)合在一起，集成了阻抗免疫傳感器，用于高效分離和檢測(cè)單核細(xì)胞增素乳桿菌。雖然免疫學(xué)和微流體學(xué)的結(jié)合極大改善了傳統(tǒng)方法的性能，但仍需進(jìn)一步研究。目前，研究較多的是對(duì)病原菌的特異性結(jié)合，而非特異性結(jié)合還是一個(gè)難題[65]。DNA和RNA適配體作為抗體的潛在競爭對(duì)手已被廣泛研究，用于包括食品安全檢測(cè)在內(nèi)的各種應(yīng)用領(lǐng)域。通過雙向電泳，可以得到適配體在微流體系統(tǒng)中定位并集中在規(guī)定的位置，從而完成對(duì)病原菌的富集[66]。

3 結(jié)論與展望

電泳技術(shù)發(fā)展較快，免疫電泳不僅具有抗原抗體的高特異性，還具有快速分離，高靈敏度和高分辨率的特點(diǎn)，但是電泳技術(shù)在結(jié)果重現(xiàn)性方面仍舊不足，因此在應(yīng)用上存在局限性。取代了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中的人工操作，速度快、效率高、避免人為失誤的可能性，為科學(xué)研究提供了新的發(fā)展方向。如果能將多種富集、檢測(cè)技術(shù)集成于自組裝的微流體元件中，將有望實(shí)現(xiàn)病原菌富集與檢測(cè)效率的最大化。免疫磁珠分離多應(yīng)用于病原菌的富集，磁珠的超順磁性能夠使病原菌與生物識(shí)別體結(jié)合的更加牢固，提高捕獲率。磁珠操作的簡便性，可使免疫磁珠與多種檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，增強(qiáng)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，提高檢出限[37]。但是，由于磁場效應(yīng)，可能會(huì)吸附雜菌，這就需要有高特異性的生物識(shí)別體對(duì)磁珠進(jìn)行修飾，降低雜菌污染幾率。因此，免疫磁珠作為富集速度快，富集率高的便攜材料可打破其他儀器在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，對(duì)快檢技術(shù)的開發(fā)有重要意義。