石榴皮多酚提取工藝優化及其貯藏穩定性研究

穆談航，葉 嘉，楊明建，苗俊玲，王新建，周小桐，張文文

（1.邯鄲學院生命科學與工程學院，河北邯鄲 056005；2.河北省高校冀南太行山區野生資源植物應用技術研發中心，河北邯鄲 056005）

石榴富含維生素、有機酸、糖類、蛋白質、脂肪，鈣、磷、鉀等礦物質[1]，以及豐富的多酚類物質，具有抗菌、抗病毒、抗癌[2]和保護心腦血管[3]及止血[4]的藥用價值。

目前，對于多酚的提取方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法，而相比較來說超聲波輔助提取法能有效提高總多酚的提取速率，具有時間短、提取量高的優點。但是，不同的超聲波工藝在實際應用方面效果存在一定差異。因此，需要進一步探究石榴多酚的最佳提取工藝。本研究首先進行了多酚最佳提取工藝的確定，為后續研究多酚儲藏穩定性打下了基礎。目前，針對多酚的研究主要集中在抑菌和抗氧化的功能上，對其儲藏穩定性的研究卻比較少見，而乳化劑可以提高食品品質[5]。及保存性質[6]。

本研究將石榴多酚與乳化劑復配后，來研究乳化劑對多酚儲藏穩定性的影響，旨在解決多酚儲藏時不穩定、暴露在空氣中易被氧化的問題，以期為多酚類天然活性物質的儲藏穩定性提供理論依據。首先，以80%甲醇作為提取劑，利用超聲波輔助法[7]，通過單因素和正交試驗確定本探究中多酚的最佳提取工藝；由于乳化劑具有良好的保鮮及抗氧化[8]特性，利用這一特性將多酚與單硬脂酸甘油酯[9]和蔗糖脂肪酸酯兩種乳化劑制成不同的乳化體系，加入到石榴多酚提取液中，通過實驗確定石榴多酚的最佳保存方法，研究不同乳化體系對多酚提取液儲藏穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 突尼斯軟籽石榴；甲醇（色譜純） 天津賽孚瑞科技有限公司、沒食子酸（99%） 安徽酷爾生物工程有限公司、福林-酚試劑Ⅱ（1mol/L H+） 天津市光復精細化工研究所；無水碳酸鈉（分析純） 天津奧普升化工有限公司；單硬脂酸甘油酯（食品級）河南千志商貿有限公司；SE-11蔗糖脂肪酸酯（食品級） 柳州愛格富食品科技股份有限公司。

KS-100B旋鈕超聲波清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司；ThermoHeraeus Multifuge X1R臺式離心機 美國Thermo公司；PA3201B電子天平上海天美天平儀器有限公司；HH2恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SK-1快速混勻器金壇市科析儀器有限公司；TGL-18B臺式高速離心機 上海安亭科學儀器廠

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴多酚提取工藝 采用齊迪[10]的提取方法并略有改動，取1 g新鮮石榴皮放入研缽研碎。加入80%的甲醇作為浸提劑，多次沖洗研缽將研碎的石榴皮轉移到小燒杯中。然后放入超聲波清洗器中，在不同條件下提取多酚，比較多酚含量，得出最優提取工藝。超聲結束后將固體和液體轉移到離心管中進行離心，離心條件為5 ℃、轉速為10000 r/min，15 min。上清即為石榴皮多酚的提取液[11]。

1.2.2 石榴多酚提取單因素實驗 設置超聲波功率固定為160 W，80%的甲醇[12]作為浸提液，在條件相同下，以多酚含量為指標，分別考察成熟程度（幼期7～8月、成熟前期8～9月、成熟期9～10月、成熟后期10～11月）、料液比[13]（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25）、提取時間[14]（10、20、30、40、50 min）、提取溫度[15]（10、20、30、40、50 ℃）、避光反應時間（10、20、30、40、50 min）5個因素影響。

1.2.3 多酚測定方法 樣品測定：采用齊迪[10]的測定方法，并略有改動。將一定量的多酚粗提液稀釋至100倍，取1 mL稀釋液于試管中并分別加入福林-酚試劑Ⅱ 0.2 mL，水6 mL，10%碳酸鈉1 mL。在室溫下避光反應30 min，在A=765 nm下測定吸光值。用水做空白對照，每組三個平行。

以沒食子酸標準溶液中溶質溶度（mg/mL）為X軸，吸光度A為Y軸，繪制標準曲線，標準曲線方程為：y=12.149x+0.0093，R2=0.9991。

式中，c：沒食子酸濃度，mg/mL；m：石榴皮質量，g；v：稀釋液體積，mL。

1.2.4 正交實驗 在單因素實驗的基礎上，考察因素為成熟程度、料液比、提取溫度、提取時間，以多酚含量為考察指標，對超聲波輔助法提取石榴皮多酚的提取工藝進行研究。正交試驗因素水平表如表1[16]所示。

表1 正交實驗因素表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 不同乳化劑對多酚儲藏穩定性的影響 本實驗分別探究質量分數（乳化劑與粗提液質量比）為0.6%、0.8%、1%的蔗糖脂肪酸酯[17]和單硬脂酸甘油酯[17]溶解于食用油和水中對石榴皮多酚粗提液儲藏穩定性的影響。共形成12種不同的乳化體系（蔗糖酯可做抗老化劑[18]，探究儲藏效果），設置不同的時間梯度，在765 nm下測定吸光值，以吸光值的變化率為儲藏率指標。

制備方法：分別稱取質量分數0.6%、0.8%、1%的兩種乳化劑與2 mL的調和油和水分別混合，放入水浴鍋中5 min（70 ℃左右），用快速混勻器輔助使其充分混合形成乳化體系，用石榴皮多酚的粗提液定容到10 mL（1:5）。再次放入水浴鍋中3 min（70 ℃左右），使其與多酚粗提液充分混合，取部分液體于離心管中，10000 r/min離心3 min，取上清測定其吸光值。其余液體放入5 ℃左右的冰箱中儲藏。

1.3 數據處理

所有試驗平行測定3次，單因素實驗、儲藏穩定性試驗數據處理及正交試驗表格用Excel作圖，用SPSS 20.0軟件進行正交分析、方差分析，以P<0.05表示有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 成熟程度對石榴多酚提取的影響 由圖1可知，石榴的不同成熟程度對石榴皮多酚的提取存在較大的影響，石榴在生長7～8個月的幼期時，石榴皮多酚含量達到5.55 mg/g，石榴在生長10～11個月的成熟后期多酚含量最低，降至3.62 mg/g。在石榴整個生長過程中，石榴皮多酚含量變化率在53.3%左右，隨著石榴的不斷成熟，石榴皮多酚的含量逐漸下降，不同的時期石榴皮多酚含量存在明顯差異，因此在石榴皮多酚提取的優化中，不同的成熟程度為重要單因素之一。原因可能是，隨著石榴的生長，其石榴表皮細胞經歷成熟、老化的生理過程，在這個過程中細胞內部生理代謝旺盛，需要消耗大量的有機物質及營養物質，且產生一些氧化物質，從而消耗部分多酚類物質參與細胞內的氧化過程，隨著細胞的逐漸衰老，次級代謝產物的消耗大于積累，造成多酚含量逐漸降低。因此石榴皮多酚提取的最佳時期在幼期。

圖1 成熟程度對多酚提取的影響Fig.1 Effects of maturity on polyphenols extraction

2.1.2 料液比對石榴多酚提取的影響 由圖2可知，從料液比在1:5～1:10之間，多酚含量隨之上升，當料液比為1:10時，多酚含量達到最大值7.3 mg/g，此時提取率達17.31%；當料液比大于1:10時，多酚含量逐漸降低。這是因為當料液比增大時，多酚等物質向細胞外擴散的濃度梯度逐漸增大，擴散速率加快，使得多酚能夠更多地進入到溶液中，多酚含量逐漸升高[19]。但料液比達到一定程度以后，該擴散速率達到最大值，多酚得率不再升高，繼續增加溶劑反而會稀釋多酚提取液溶度[20]。因此，適宜的料液比為1:10。

圖2 料液比對多酚提取的影響Fig.2 Effect of material liquid ratio on polyphenols extraction

2.1.3 提取時間對石榴多酚提取的影響 由圖3可知，提取時間由10～40 min之間多酚含量呈上升趨勢，提取時間為40 min時，多酚含量達最大值為6.6 mg/g，提取率達33.79%，此后多酚含量出現下降趨勢。如果多酚提取時間太短，胞內物質不易溶出，10 min時多酚含量僅為4.37 mg/g，提取率比較低；如果提取時間過長，多酚類物質結構容易遭到破壞，從而影響石榴皮多酚提取效果[21]。因此，適宜的提取時間為40 min。

圖3 提取時間對多酚提取的影響Fig.3 Effect of extraction time on polyphenol extraction

2.1.4 提取溫度對石榴多酚提取的影響 由圖4可知，在20 ℃時多酚含量達最大值為7.16 mg/g，在此之前，很可能是由于溫度過低，導致多酚溶出速度過慢，效率比較低[22]。在20 ℃時達到最大值之后，隨著溫度的逐漸升高，多酚的提取量隨之下降，是因為多酚類物質受熱穩定性較差，過高的溫度使得多酚結構容易被破壞，對多酚本身結構產生較大影響，從而導致多酚含量降低[23]。因此，適宜的提取溫度為20 ℃左右。

圖4 提取溫度對多酚提取的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on polyphenol extraction

2.1.5 避光反應時間對石榴多酚提取的影響 由圖5可知，避光反應時間在30～50 min之間時多酚含量趨于平穩，10、20 min時多酚含量明顯低于30 min時的多酚含量，20 min時多酚含量為4.90 mg/g，與最高值相差42.04%，因此避光反應時間對多酚含量測定存在較大影響。原因可能是在30 min之前，該體系反應不完全，導致吸光值低。因此，適宜的反應時間為40 min。

圖5 避光反應時間對多酚提取的影響Fig.5 Effect of dark reaction time on polyphenol extraction

因為避光反應時間在30～50 min范圍內變化趨勢不明顯，因此不選做正交試驗考察因素。綜上，選取成熟度、料液比、提取時間、提取溫度四個因素進行正交試驗。

2.2 正交試驗

為了進一步探究各因素對石榴皮多酚超聲提取的影響，對表2中的數據進行方差分析，由于D因素的R值最小，將其作為空白列進行分析，結果如表3所示。

由表3可知，對石榴皮多酚超聲波輔助法提取工藝優化試驗中，所考察的四個因素對石榴皮多酚的提取均無顯著性影響。由表2可知，表中最佳的為4組合A2B1C1D1，總多酚的含量為10.74 mg/g，由k值得到的最佳組合為A1B1C2D3。為驗證結果，分別用A1B1C2D3和A2B1C1D1兩種提取方法提取多酚，石榴皮多酚的含量分別為11.47 mg/g和10.11 mg/g。結果表明，石榴皮多酚提取的最佳工藝條件是：A1B1C2D3，即：成熟程度為幼期，料液比為1:5，提取溫度為20 ℃，提取時間為50 min。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結果Table 3 Analysis results of variance

2.3 不同乳化體系對多酚提取液儲藏穩定性的影響

2.3.1 蔗糖脂肪酸酯對多酚粗提液穩定性影響 通過研究蔗糖酯分別以水和食用油為連續相形成的6種不同的乳化體系發現（圖6），以食用油為連續相的實驗組，沒有以水為連續相時的留存率高。儲藏15 d后，以食用油為連續相的實驗組中，質量分數為1.0%的乳化體系多酚留存率最高，達98.58%，對照組僅為63.34%；以水為連續相的實驗組中，質量分數為1.0%的乳化體系多酚留存率最高，達104.24%，對照組僅為71.62%，以水為連續相儲藏效果優于以食用油為連續相。這是由于蔗糖酯是水溶性表面活性劑，在水相中具有更好的分散和穩定性[24]。但是，不管在油相還是水相中，隨著蔗糖酯質量分數的增加，多酚留存率均呈上升趨勢，說明蔗糖酯形成的乳化體系對多酚的儲藏有積極作用，且在一定范圍內與其質量分數呈正相關關系。

圖6 蔗糖酯對多酚穩定性影響Fig.6 Effect of sucrose fatty acid ester on the stability of polyphenols

2.3.2 單硬脂酸甘油酯對多酚粗提液穩定性影響 由圖7可知，以食用油為連續相的實驗組，比以水為連續相時留存率高。儲藏15 d后，以食用油為連續相的實驗組中，質量分數為1.0%的乳化體系多酚留存率最高，達85.42%，對照組僅為69.24%；以水為連續相的實驗組中，質量分數為0.6%的乳化體系多酚留存率最高，達85.14%，對照組僅為73.45%，說明單甘脂在以食用油為連續相時儲藏效果優于以水為連續相。這是由于單甘脂為脂溶性表面活性劑，在油相中具有更好的分散和穩定性。但是，與蔗糖酯相比，單甘脂的保存效果仍然偏低，故對于石榴多酚儲藏穩定性來說，質量分數為1.0%的蔗糖酯與水形成的乳化體系保存效果最佳。

圖7 單甘酯對多酚穩定性影響Fig.7 Effect of monostearate on stability of polyphenols

3 結論

首先采用單因素和正交試驗的方法，得到了各因素對石榴皮多酚粗提液的影響大小：料液比>成熟程度>提取溫度>提取時間。優化的石榴皮多酚超聲輔助法提取工藝為：成熟程度為幼期，料液比為1:5，提取溫度為20 ℃，提取時間為50 min，此時多酚最佳含量為11.47 mg/g。

在儲藏穩定性實驗中，蔗糖酯以水為連續相形成的乳化體系對石榴多酚儲藏效果優于以食用油為連續相，而單甘酯則與之相反。這與兩種表面活性劑的HLB值有關，親水親油性決定了它們形成復合體系的分散和穩定性，也決定了它們對多酚的保護作用。這兩種不同的乳化劑相比，蔗糖酯對多酚儲藏穩定性的作用效果優于單甘酯，且效果在一定范圍內與蔗糖酯的添加量呈正相關關系。