黃水基質(zhì)微生物發(fā)酵合成γ-聚谷氨酸培養(yǎng)基及條件優(yōu)化

王風(fēng)青，畢長富，王 川，王 凝，龔利娟，周麗洪，王竹青

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644004）

傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒生產(chǎn)過程中，經(jīng)微生物分解代謝后產(chǎn)生的大量游離水，這些水將酒醅中的酸、可溶性淀粉、酵母溶出物、還原糖、單寧、酒精及香味前體物質(zhì)溶出，再與酒醅中未被微生物所利用的水逐漸沉降，最后慢慢沉積在窖池底部而形成棕褐色、呈流體狀的液體，這種液體被稱為之黃水[1]，是白酒釀造過程中的副產(chǎn)物之一。黃水又稱黃漿水，含有醇類、酸類、醛類、酯類等呈香呈味物質(zhì)，還含有經(jīng)長期馴化的有益微生物、糖類物質(zhì)、含氮化合物和少量的單寧及色素等有機(jī)物[2]，氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)黃水中約含有8.2 g/L的還原糖、2.6%的乙醇、4.73 g/L的總酸以及多種微量成分[2]。黃水酸度比較低，通常pH在3～4之間，高化學(xué)需氧量（COD）25000～40000 mg/L，高生化需氧量（BOD）25000～30000 mg/L[3]。有數(shù)據(jù)顯示，約生產(chǎn)1000 kg的大曲酒，就會大約有300～400 kg的副產(chǎn)物黃水產(chǎn)生[4]，所以黃水的綜合利用，不僅可以適當(dāng)解決白酒行業(yè)頭疼的“污染源”，還能有效提高經(jīng)濟(jì)和社會效益。

目前，對黃水的綜合利用主要有兩條途徑：一是用于提高產(chǎn)酒質(zhì)量；二是用于開發(fā)新產(chǎn)品。促進(jìn)窖泥老熟、進(jìn)行人工培窖、窖池養(yǎng)護(hù)，拌糟醅二次發(fā)酵是黃水提高產(chǎn)酒質(zhì)量的主要應(yīng)用措施[5]，另外還可以利用其中的有益微生物添加到大曲中做成強(qiáng)化大曲[6]，采用酯化反應(yīng)制得酯化液，用來勾調(diào)低檔白酒，提高酒中的香味成分含量，增強(qiáng)酒體自然協(xié)調(diào)的渾厚感，從而提高低檔白酒的品質(zhì)[7]。以黃水為原料，利用吸水樹脂制備白酒調(diào)味劑[8]。利用黃水中的有機(jī)營養(yǎng)物，通過微生物發(fā)酵開發(fā)新產(chǎn)品，如食醋、醬油、乳酸鈣、丙酸、絮凝劑等[9?14]。

γ-聚谷氨酸（Polyγ-glumatic acid，γ-PGA）是一種由D-和L-谷氨酸單體組成的生物可降解無毒害的陰離子均聚物。γ-PGA特殊的分子結(jié)構(gòu)，使其具有很好的乳化、增稠、抗凍等特性[15?17]，可作為添加劑廣泛應(yīng)用于食品當(dāng)中。目前，γ-PGA的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法以及微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法合成路線復(fù)雜、得到的γ-PGA分子量較小、副產(chǎn)物多、收率低且需要光電等有毒氣體；酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的γ-PGA分子量小，而分子量的大小直接影響到γ-PGA的性質(zhì)與功效；微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA，條件溫和，合成產(chǎn)物分子量較大，且分子量可依據(jù)發(fā)酵微生物種類、培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件的不同而有差異，因此微生物發(fā)酵合成γ-PGA成了現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)[18]。

因此，利用黃水發(fā)酵合成高分子量的聚合物γ-PGA，不僅可以使白酒產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物—黃水，資源化利用，同時得到一高產(chǎn)值新產(chǎn)品γ-PGA，可以對白酒產(chǎn)業(yè)效益的提升及白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展做出一定的貢獻(xiàn)。本文用自己分離篩選到的菌株，以黃水為基質(zhì)，通過單因素及響應(yīng)面試驗，對其發(fā)酵合成γ-PGA的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期用低成本的原料生產(chǎn)高產(chǎn)值的γ-PGA。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗菌種 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisYB18，本實驗室分離鑒定并保藏；黃水 取自四川某白酒廠，實驗室冰柜保存?zhèn)溆?；玉米粉、味?市售；蛋白胨、牛肉粉、α-淀粉酶（3700 U/g）、糖化酶（100000 U/g）均為奧博星生物試劑；其余試劑 均為分析純。

SBA40S生物傳感分析儀 濟(jì)南研科實驗儀器有限公司；THZ-A氣浴恒溫振蕩器 上海助藍(lán)儀器科技有限公司；YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-25臺式酸度計 上海雷磁；NDJ-5S數(shù)字式粘度計 德卡緊密量儀（深圳）有限公司；752N紫外可見分光光度計上海諾科儀器儀表有限公司；R1-TGC-N50高速離心機(jī) 無錫市瑞江分析儀器有限公司；H10-50133生化培養(yǎng)箱 天津宏諾儀器有限公司；

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉3 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min，37 °C培養(yǎng)24 h。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉3 g/L，葡萄糖20 g/L，NaCl 10 g/L，水10000 mL，pH7.0～8.0，裝液量50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速150 r/min，37 °C振蕩培養(yǎng)18 h。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米糖化液40 g/L（按可溶性固形物計），谷氨酸鈉30 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉3 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，接種量2%（v/v），裝液量50 mL/250 mL，溶解于適當(dāng)濃度的黃水中，pH6.0，轉(zhuǎn)速150 r/min，37 °C振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 黃水的預(yù)處理 用濃氫氧化鈉溶液調(diào)整黃水pH至7.0，然后用自來水稀釋一定倍數(shù)后備用。

1.2.3 玉米糖化液的制備 在鍋里加入3000 mL水，3.0 g無水CaCl2，煮沸，加入1000 g玉米粉，攪拌糊化，按12 U/g的添加量加入α-耐溫淀粉酶，保溫15 min后，降溫至65 °C左右，用鹽酸調(diào)pH值至4.5左右，按200 U/g的添加量加入糖化酶，60 ℃保溫4 h后，加熱煮沸10 min，紗布過濾除渣，低溫保存?zhèn)溆肹19]。

1.2.4 黃水基質(zhì)微生物發(fā)酵合成γ-PGA培養(yǎng)基及條件單因素實驗

1.2.4.1 黃水稀釋倍數(shù)對發(fā)酵合成γ-PGA的影響將黃水調(diào)整pH至6.0左右，加自來水分別稀釋至6、7、8、9、10倍，作為溶劑，按照試驗方法1.2.1配制發(fā)酵培養(yǎng)基并發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵液中γ-PGA含量、發(fā)酵液粘度及前體物谷氨酸鈉的殘余量，以此確定黃水的稀釋倍數(shù)。

1.2.4.2 碳源種類及濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響

分別以40 g/L的葡萄糖、蔗糖、糊精、可溶性淀粉代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米糖化液，按照實驗方法1.2.1配制發(fā)酵培養(yǎng)基并發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵液中γ-PGA含量、發(fā)酵液粘度及前體物谷氨酸鈉的殘余量，選擇前三種較優(yōu)的碳源，做添加量單因素實驗，以此綜合考慮黃水基質(zhì)發(fā)酵合成γ-PGA的過程中最合適的碳源種類及濃度；

1.2.4.3 氮源種類及濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響

分別以40 g/L牛肉浸粉、黃豆粉、尿素、大豆蛋白胨、氯化銨、酵母浸粉、硫酸銨、檸檬酸三銨代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，按照實驗方法1.2.1配制發(fā)酵培養(yǎng)基并發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵液中γ-PGA含量、發(fā)酵液粘度及前體物谷氨酸鈉的殘余量，選擇較優(yōu)的氮源，做添加量單因素實驗，以此綜合考慮黃水基質(zhì)發(fā)酵合成γ-PGA的過程中最合適的氮源種類及濃度；

1.2.4.4 前體物谷氨酸鈉對發(fā)酵合成γ-PGA的影響

調(diào)整基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中谷氨酸鈉濃度分別為20、25、30、35、40、45、50、55 g/L，按照實驗方法1.2.1配制發(fā)酵培養(yǎng)基并發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵液中γ-PGA含量、發(fā)酵液粘度及前體物谷氨酸鈉的殘余量，以此綜合考慮發(fā)酵培養(yǎng)基中谷氨酸鈉的添加量；

1.2.4.5 氯化鈉濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響 調(diào)整基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉濃度分別為4、5、6、7、8、9、10、11 g/L，按照實驗方法1.2.1配制發(fā)酵培養(yǎng)基并發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵液中γ-PGA含量、發(fā)酵液粘度、殘余谷氨酸及前體物谷氨酸鈉的殘余量，以此綜合考慮發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉的添加量；

1.2.4.6 磷酸氫二鉀濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響

調(diào)整基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀濃度分別為2、3、4、5、6、7、8 g/L，按照試驗方法1.2.1配制發(fā)酵培養(yǎng)基并發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵液中γ-PGA含量、發(fā)酵液粘度及前體物谷氨酸鈉的殘余量，以此綜合考慮發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀的添加量；

1.2.4.7 裝液量對發(fā)酵合成γ-PGA的影響 調(diào)整實驗方法1.2.1中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量分別為25、35、45 mL/250 mL，其余條件不變，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵液中γ-PGA含量、發(fā)酵液粘度、前體物谷氨酸鈉的殘余量及葡萄糖殘余量，以此綜合考慮搖床發(fā)酵時的裝液量；

1.2.4.8 接種量對發(fā)酵合成γ-PGA的影響 調(diào)整實驗方法1.2.1中接種量分別為1、2、3、4、5、6%（v/v），其余條件不變，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵液中γ-PGA含量、發(fā)酵液粘度、前體物谷氨酸鈉的殘余量及葡萄糖殘余量，以此綜合考慮最合適的接種量；

1.2.4.9 發(fā)酵時間對發(fā)酵合成γ-PGA的影響 調(diào)整實驗方法1.2.1中發(fā)酵時間分別為24、48、72、96 h，其余條件不變，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵液中γ-PGA含量、發(fā)酵液粘度、前體物谷氨酸鈉的殘余量及葡萄糖殘余量，以此綜合考慮最佳發(fā)酵時間；

1.2.5 Plackett-Burman設(shè)計篩選對γ-PGA產(chǎn)量影響顯著的因素 依據(jù)單因素試驗的結(jié)果以及本論文沒有展現(xiàn)的pH條件試驗結(jié)果，利用Plackett-Burman設(shè)計篩選γ-PGA產(chǎn)量影響顯著因素。本試驗采用n=12的Plackett-Burman設(shè)計，選取影響γ-PGA產(chǎn)量的9個主要因素，其中，高水平“1”是低水平“?1”的1.5～2倍。對于試驗結(jié)果，分別計算各因素的效應(yīng)，并對各因素效應(yīng)進(jìn)行t檢驗，理論選擇置信度大于95%的因素作為顯著因素進(jìn)一步考察。Plackett-Burman設(shè)計因素水平值見表1。

1.2.6 最陡爬坡試驗確定中心點(diǎn) 確定響應(yīng)面試驗因素水平的中心點(diǎn)，只有在考察的臨近區(qū)域里才能較好地反映真實情形，所以，應(yīng)先逼近最大γ-PGA產(chǎn)量區(qū)域后再建立有效的擬合方程。依據(jù)Plackett-Burman設(shè)計試驗結(jié)果，選取P<0.1的因素，呈現(xiàn)正效應(yīng)，取高水平，再增加；呈現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)，取低水平，再減少；其它影響不顯著的取低水平進(jìn)行試驗。

1.2.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計 確定最顯著因素的最優(yōu)水平：逼近最大γ-PGA產(chǎn)量區(qū)后，進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計，以試驗結(jié)果擬合建立描述響應(yīng)量（γ-PGA產(chǎn)量）與自變量（影響γ-PGA產(chǎn)量的顯著因素）關(guān)系的多項式回歸模型，再對擬合方程進(jìn)行規(guī)范性分析，尋找回歸模型的穩(wěn)定點(diǎn)，得到最大γ-PGA產(chǎn)量時顯著因素的最優(yōu)水平，并進(jìn)行試驗驗證。Box-Behnken設(shè)計的因素水平情況見表2。

1.2.8 檢測方法

1.2.8.1γ-PGA產(chǎn)量的測定 十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）沉淀法，簡稱CTAB沉淀法[20]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：準(zhǔn)確量取0.0200 gγ-PGA標(biāo)準(zhǔn)樣品，用離子水定容至100 mL，配制成200 μg/mL的γ-PGA母液，然后分別取母液0.75、1.5、2.25、3、3.75、4.5、5.25、6 mL，定容至30 mL，分別與2 g/L的CTAB溶液（用5%的NaOH溶液配制）1:1混合，待反應(yīng)3 min左右在250 nm紫外可見分光光度計下測其吸光值，以γ-PGA濃度作為橫坐標(biāo)，其吸光度作為為縱坐標(biāo)，得到其回歸曲線：y=0.0133x?0.0024，R2=0.992。

發(fā)酵液的測定：取適量發(fā)酵液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，12000 r/min離心5 min，加入2 mL CTAB溶液反應(yīng)形成混懸液，經(jīng)過3 min反應(yīng)后在250 nm紫外可見分光光度計下測出其吸光值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線并換算出稀釋倍數(shù)后得出實際的γ-PGA濃度值。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken設(shè)計的因素水平表Table 2 Factors and levels table of Box-Behnken design

1.2.8.2 可溶性固形物含量的測定 使用LH-F90折光儀，校準(zhǔn)調(diào)零后，直接進(jìn)行測定。

1.2.8.3 葡萄糖與谷氨酸含量的測定 發(fā)酵液用去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用SBA-40E 生物傳感分析儀（配有β-D-葡萄糖檢測膜及L-谷氨酸檢測膜）直接檢測[21]。

1.2.8.4 粘度的測定 由于液體表面具有張力，在流動時連帶多層液體聯(lián)動，即我們說的粘度。粘度采用NDJ-5S 數(shù)字式粘度計，室溫下用2號轉(zhuǎn)子在轉(zhuǎn)速為60 r/min條件下直接測定[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有單因素實驗都進(jìn)行3組平行，重復(fù)3次，數(shù)據(jù)的處理及作圖用Microsoft Excel 2010工作表完成；響應(yīng)面試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析均采用Minitab 19軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水基質(zhì)發(fā)酵合成γ-PGA培養(yǎng)基及條件單因素實驗

2.1.1 黃水稀釋倍數(shù)對發(fā)酵合成γ-PGA的影響 黃水酸度大，具有較高的抑菌活性[23]，其中的抑菌因子可以通過抑制細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸的合成而實現(xiàn)抑制作用[24]。因此要采用實驗菌株在黃水中生長且代謝目的產(chǎn)物，首先需要采用適當(dāng)?shù)氖侄螌S水進(jìn)行前處理。實驗嘗試了通過蒸煮、調(diào)節(jié)酸度、稀釋等方式進(jìn)行預(yù)處理，使得實驗菌株枯草芽孢桿菌可以黃水為基質(zhì)，黃水中微量元素為增產(chǎn)因子，發(fā)酵合成高產(chǎn)值的γ-PGA。

剛采集的黃水有輕微的氨水味，高溫滅菌處理后，既能減輕這種氨水味道，還能使得殘留的酒精蒸發(fā)，同時用濃氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.0左右，加入8倍自來水稀釋（見圖1），添加必要組分后即可以作為基質(zhì)，發(fā)酵合成γ-PGA，產(chǎn)量最高，約8.5 g/L。一般認(rèn)為，發(fā)酵液粘度與γ-PGA產(chǎn)量以及分子量相關(guān)，γ-PGA產(chǎn)量越大，分子量越大，粘度也越高[25]。黃水在稀釋8倍時，發(fā)酵液粘度最高，說明此條件下發(fā)酵合成的γ-PGA分子量可能最高。試驗菌株為谷氨酸依賴型菌，要合成γ-PGA，需要添加外源的谷氨酸，黃水稀釋8倍時，發(fā)酵液中γ-PGA產(chǎn)量最高的同時殘余的谷氨酸最低，正好驗證了試驗菌株發(fā)酵合成γ-PGA是需要外加谷氨酸作為底物的。以下試驗對其基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組分濃度及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 黃水稀釋倍數(shù)對發(fā)酵合成γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of yellow water dilution multiple on γ-PGA yield

2.1.2 碳源種類及濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響碳源在微生物生長和代謝中的作用主要是為細(xì)胞提供碳骨架及其支撐生命活動的能量，同時也為一些特殊代謝產(chǎn)物提供碳骨架。因此，合適的碳源類型和濃度對于微生物的生長及其目的產(chǎn)物合成有著十分重大的影響[26]。圖2顯示，以蔗糖為碳源發(fā)酵時，γ-PGA合成產(chǎn)量最高，發(fā)酵液粘度也較高。同時還發(fā)現(xiàn)，碳源種類不同，發(fā)酵合成γ-PGA產(chǎn)量與發(fā)酵液粘度有不同步的差異，這個現(xiàn)象也可以作為發(fā)酵合成不同分子量γ-PGA需求的依據(jù)。有研究指出，在一些可以發(fā)酵合成γ-PGA的枯草芽孢桿菌中，都存在谷氨酸脫氫酶代謝途徑生成L-谷氨酸[27?28]。試驗結(jié)果顯示，碳源種類的不同，發(fā)酵所消耗谷氨酸量基本一致，但γ-PGA的產(chǎn)量卻有明顯的差異。說明當(dāng)發(fā)酵碳源為蔗糖時，在消耗相同外源添加谷氨酸的情況下，γ-PGA產(chǎn)量相對較高，是因為菌體自身可能代謝一定量谷氨酸，用于γ-PGA合成。

圖2 不同碳源對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on γ-PGA of fermentation synthesis

依據(jù)圖2的實驗結(jié)果，γ-PGA產(chǎn)量相對較高的三種碳源（蔗糖、糊精、玉米糖化液），分別進(jìn)行濃度單因素試驗，進(jìn)一步驗證并尋求比較合適的添加濃度。

以蔗糖為單一碳源發(fā)酵，試驗結(jié)果（圖3）顯示，蔗糖濃度為60 g/L時，γ-PGA的產(chǎn)量隨著蔗糖濃度的增加而趨于穩(wěn)定；蔗糖濃度為70 g/L時，發(fā)酵液粘度隨著蔗糖濃度的增加而趨于穩(wěn)定，但始終都比較?。浑S著蔗糖濃度的增加，前體物谷氨酸的消耗量基本恒定。因此，以蔗糖為碳源發(fā)酵合成γ-PGA時，其添加量可以選擇60 g/L。

圖3 蔗糖濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.3 Effects of sucrose concentration on γ-PGA of fermentation synthesis

以糊精為單一碳源發(fā)酵，試驗結(jié)果（見圖4）顯示，伴隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中糊精添加量的增加，前體物谷氨酸的消耗量基本恒定，發(fā)酵液粘度及γ-PGA產(chǎn)量在添加糊精25 g/L時達(dá)到最大。

圖4 糊精濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.4 Effects of dextrin concentration on γ-PGA of fermentation synthesis

以玉米糖化液為單一碳源發(fā)酵，試驗結(jié)果（見圖5）顯示，隨著添加玉米糖化液濃度的增加，殘余葡萄糖量基本都消耗殆盡，而γ-PGA的產(chǎn)量一直處于上升趨勢，殘余谷氨酸的消耗量緩慢減少，發(fā)酵液粘度緩慢上升。發(fā)酵液粘度在玉米糖化液添加濃度50 g/L時，達(dá)到最大值，但就葡萄糖的消耗曲線以及γ-PGA的合成曲線看，可以再進(jìn)一步試驗，以確定γ-PGA產(chǎn)量達(dá)到最大值時的玉米糖化液添加濃度。

圖5 玉米糖化液濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.5 Effects of corn saccharifying liquid concentration on γ-PGA of fermentation synthesis

玉米糖化液是玉米粉經(jīng)雙酶糖化所得，除了主要的葡萄糖外，還含有少量的糊精、二糖等，甚至可能還含有微量的增產(chǎn)因子，所以綜合考慮，黃水基質(zhì)發(fā)酵合成γ-PGA的碳源可以選用玉米糖化液。

2.1.3 氮源種類及濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響凡是能為微生物生長繁殖提供氮元素的物質(zhì)均為氮源。氮是構(gòu)成重要生命物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，為細(xì)胞合成基物質(zhì)代謝提供原料，與碳源相似，也是微生物的主要營養(yǎng)源[29]。同時氮源的種類和濃度還會很大程度上影響次級代謝目的產(chǎn)物的合成。圖6顯示，以牛肉浸粉為氮源時，發(fā)酵液的粘度比其它幾種氮源的高出5～7倍，γ-PGA產(chǎn)量也最高。進(jìn)一步以牛肉浸粉為氮源，進(jìn)行單因素試驗，考察添加濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響，結(jié)果（見圖7）顯示，隨著培養(yǎng)基中牛肉粉的添加量的增加，γ-PGA產(chǎn)量在牛肉浸粉濃度為70 g/L時達(dá)到最大值，發(fā)酵液的粘度也最大。所以黃水基質(zhì)發(fā)酵合成γ-PGA培養(yǎng)基中添加的氮源為70 g/L的牛肉浸粉。

圖6 氮源種類對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on γ-PGA of fermentation synthesis

圖7 牛肉粉濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.7 Effects of beef powder concentration on γ-PGA of fermentation synthesis

2.1.4 前體物谷氨酸鈉對發(fā)酵合成γ-PGA的影響γ-PGA生產(chǎn)菌有兩種，一種為谷氨酸依賴型，另一種為非谷氨酸依賴型。對于非谷氨酸依賴型菌株，不需要外加谷氨酸，利用其自身合成的谷氨酸作為γ-PGA合成的原料。但是目前報道的非谷氨酸依賴型菌株生產(chǎn)γ-PGA的產(chǎn)量都比較低[30]。對于谷氨酸依賴型的菌株，需要外加谷氨酸，再利用自身合成酶系統(tǒng)去合成γ-PGA。預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)添加谷氨酸鈉量為0時，沒有合成γ-PGA，說明試驗菌株為谷氨酸依賴型菌種。試驗結(jié)果（見圖8）顯示，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中谷氨酸鈉添加量的增加，γ-PGA的產(chǎn)量在谷氨酸鈉添加量為45 g/L時達(dá)到最大值，隨后下降；發(fā)酵液粘度隨著在谷氨酸鈉濃度的增加，沒有太大變化，直到谷氨酸鈉添加量為45 g/L時，發(fā)酵液粘度達(dá)到最大值，隨后有一定程度的下降；前體物谷氨酸鈉的剩余量及其利用率（發(fā)酵液中剩余的谷氨酸量除以添加的谷氨酸鈉的量），隨著其添加量的增加有小幅度的增加，可見發(fā)酵液中前體物的濃度越高，越有助于產(chǎn)物γ-PGA的合成，但當(dāng)谷氨酸鈉濃度增加到一定值，這種促進(jìn)作用就會減弱甚至消失。綜上選擇培養(yǎng)基中谷氨酸鈉的合適添加量為45 g/L。

圖8 谷氨酸鈉濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.8 Effects of sodium glutamate concentration on γ-PGA of fermentation synthesis

2.1.5 氯化鈉濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響 大多數(shù)微生物的生長均適合于在等滲環(huán)境中生長，環(huán)境中鹽濃度太低，細(xì)胞脫水使得細(xì)胞不能生長甚至死亡；環(huán)境中鹽濃度太高，環(huán)境中的水進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞膨脹甚至破裂死亡，而且微生物的耐受程度也因種類不同而有差異。試驗結(jié)果（見圖9）顯示，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉的添加量的增加，γ-PGA產(chǎn)量及發(fā)酵液粘度逐漸增加，在氯化鈉濃度為10 g/L時，γ-PGA產(chǎn)量計發(fā)酵液粘度均達(dá)到最大值，且此時前體物谷氨酸的利用率也較大。綜合考慮，氯化鈉的添加量為10 g/L。

圖9 氯化鈉濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.9 Effects of sodium chloride concentration on γ-PGA of fermentation synthesis

2.1.6 磷酸氫二鉀濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響微生物的生長繁殖及產(chǎn)物的合成都需要無機(jī)鹽提供的大量元素，如細(xì)胞的組成元素磷，生理調(diào)節(jié)物質(zhì)鉀等，試驗中添加磷酸二氫鉀作為磷和鉀的供體，考查其對發(fā)酵合成γ-PGA的影響，結(jié)果見圖10。γ-PGA的產(chǎn)量及發(fā)酵液粘度在磷酸氫二鉀濃度為7 g/L時有大幅度的提高且為最大值；磷酸氫二鉀濃度的不同，對發(fā)酵過程中前體物谷氨酸的利用率沒有太大影響。綜合考慮，選擇添加的磷酸氫二鉀濃度為7 g/L。

圖10 磷酸氫二鉀濃度對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.10 Effects of potassium hydrogen phosphate concentration on γ-PGA of fermentation synthesis

2.1.7 裝液量對發(fā)酵合成γ-PGA的影響 對于好氧菌的發(fā)酵，溶氧是一個重要控制參數(shù)，過高，影響次級代謝產(chǎn)物的合成；過低，影響細(xì)胞呼吸，代謝異常；臨界氧濃度，是指不影響細(xì)胞呼吸時的氧濃度[31]。具體的臨界氧濃度與微生物本身的呼吸強(qiáng)度、培養(yǎng)基組分、菌齡、代謝物的積累、溫度等相關(guān)。對于實驗室振蕩培養(yǎng)箱，溶氧的控制可以考慮從兩個因素考慮，分別是裝液量和轉(zhuǎn)速。本試驗是以裝液量來考察溶氧對發(fā)酵合成γ-PGA的影響，試驗結(jié)果（見圖11）顯示，發(fā)酵合成γ-PGA，溶氧對菌體的影響較大，裝液量越小，相對溶氧較大，發(fā)酵合成γ-PGA產(chǎn)量越大，發(fā)酵液粘度也是越大。因此，在三角瓶搖床發(fā)酵中，可以選擇裝液量為25 mL/250 mL。在之后的研究中，可以 采用發(fā) 酵 罐發(fā)酵，進(jìn)一步增加氧的供給，并通過在線的溶氧檢測系統(tǒng)，尋求合適的溶氧值及溶氧控制條件。

圖11 裝液量對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.11 Effects of liquid volume in flask on γ-PGA of fermentation synthesis

2.1.8 接種量對發(fā)酵合成γ-PGA的影響 接種量通常與發(fā)酵菌種調(diào)整期的持續(xù)時間、產(chǎn)物合成的時間、產(chǎn)物量、菌體量等相關(guān)，合適的接種量既可以保證足夠的菌體量，又可以讓其代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最大化。黃水基質(zhì)發(fā)酵合成γ-PGA過程中（見圖12），隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中接種量的的增大，γ-PGA產(chǎn)量沒有明顯變化；在接種量為大于2%時，隨著接種量的增大，發(fā)酵液粘度由約124 mPa·s增大至約129.5 mPa·s，發(fā)酵液中剩余的谷氨酸量由約19 g/L減少至13 g/L，在6%時發(fā)酵液粘度達(dá)到最大值，底物谷氨酸剩余最少。因此，從經(jīng)濟(jì)成本方面考慮，可以選取接種量1%為適宜接種量。

圖12 接種量對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.12 Effects of inoculation amount on γ-PGA of fermentation synthesis

2.1.9 發(fā)酵時間對發(fā)酵合成γ-PGA的影響 微生物發(fā)酵合成γ-PGA的生產(chǎn)菌株中，除了含有γ-PGA合成相關(guān)的酶基因，通常也含有γ-PGA降解相關(guān)酶基因，特定環(huán)境刺激相關(guān)的酶基因表達(dá)用于合成或者降解[32?35]。發(fā)酵時間直接影響著產(chǎn)物的合成量，時間太短，產(chǎn)物合成量低，但時間超過了適當(dāng)值，產(chǎn)物有可能會被降解而造成產(chǎn)量的下降。實驗結(jié)果顯示（圖13），發(fā)酵72 h時，γ-PGA產(chǎn)量最大，隨著發(fā)酵時間的進(jìn)一步延長至96 h時，培養(yǎng)基中糖的消耗殆盡，某些因素可能激發(fā)了γ-PGA合成降解相關(guān)酶基因的表達(dá)[36]，致使合成的γ-PGA被降解，表現(xiàn)為發(fā)酵液中γ-PGA檢測值降低，所以與此同時出現(xiàn)了發(fā)酵液中谷氨酸濃度的小幅升高。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計篩選對γ-PGA產(chǎn)量影響顯著的因素

試驗設(shè)計檢測γ-PGA結(jié)果見表3，各因素的系數(shù)估計和效應(yīng)評價見表4。

表3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及響應(yīng)值（n=12）Table 3 Plackett-Burman experimental design and response value (n=12)

圖13 發(fā)酵時間對發(fā)酵合成γ-PGA的影響Fig.13 Effects of fermentation time on γ-PGA of fermentation synthesis

由表4可知，對微生物發(fā)酵合成γ-PGA有比較顯著影響(置信度大于90%，P<0.1)的因素有玉米糖化液、氯化鈉及裝液量，其中，玉米糖化液和氯化鈉對γ-PGA產(chǎn)量影響呈現(xiàn)正效應(yīng)，裝液量呈現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)。

2.3 最陡爬坡試驗確定中心點(diǎn)

依據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，玉米糖化液和氯化鈉對γ-PGA產(chǎn)量影響呈現(xiàn)正效應(yīng)，取高水平，應(yīng)再增加；裝液量呈現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)，取低水平，應(yīng)再減少；3個因素的步長依次取0.05、0.5、?0.1，其它因素影響不顯著，取低水平。最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果見表5，最大γ-PGA產(chǎn)量區(qū)在第4次試驗附近，所以，以試驗4的條件為響應(yīng)面試驗因素水平的中心點(diǎn)，即：裝液量為25 mL/250 mL，玉米糖化液的濃度為75 g/L，氯化鈉的濃度為12 g/L。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計確定最顯著因素的最優(yōu)水平

利用Minitab 19軟件對裝液量、玉米糖化液和氯化鈉設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計，結(jié)果見表6，方差分析見表7。所選擇的回歸模型的P值為0.004，表明整體模型對試驗結(jié)果具有顯著的影響，具有可信度；而失擬項的P值為0.403，大于0.05，失擬項檢驗不顯著，模型選擇適當(dāng)。一次項A對結(jié)果影響較顯著（P<0.1）、二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P<0.01）、交互項AC對結(jié)果影響顯著（P<0.05）。調(diào)整后的（R2）=90.06%，表明90.06%的γ-PGA產(chǎn)量變化可由此模型解釋。γ-PGA產(chǎn)量（Y）對裝液量（A）、玉米糖化液（B）和氯化鈉（C）的多元二次回歸方程為：

表4 Plackett-Burman 設(shè)計的各因素的系數(shù)的估計及效應(yīng)評價（α=0.1，置信度90%）Table 4 Estimates of factors coefficient and effect evaluation of Plackett Burman design (α=0.1, Confidence levels 90%)

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of maximum steep slope climbing test

Y=?520.2+3.75A+11.30B+10.10C?0.0818A2?0.0714B2?0.4354C2?0.0082AB+0.0878AC?0.0253BC

裝液量、玉米糖化液添加量和氯化鈉添加量個因素兩兩交互對γ-PGA產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖14。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiment

由圖14可知，二次項系數(shù)為負(fù)值，其所代表的拋物面開口向下，表明方程具有最大值。利用軟件分析計算，最適裝液量為25.558 mL/250 mL、玉米糖化液的濃度為75.472 g/L，氯化鈉濃度為11.979 g/L時，γ-PGA產(chǎn)量最大為14.597 g/L?？紤]實際操作可行性，將上述最優(yōu)條件修正為裝液量為25 mL/250 mL、玉米糖化液的濃度為75 g/L，氯化鈉濃度為12 g/L。以此最優(yōu)條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗，測得γ-PGA平均產(chǎn)量為14.510 g/L，與預(yù)測擬合度達(dá)99.40%，表明優(yōu)化模型可靠。

表7 響應(yīng)值的方差分析Table 7 ANOVA analysis of response values

圖14 裝液量、氯化鈉和玉米糖化液影響γ-PGA產(chǎn)量的響應(yīng)圖和等高線圖Fig.14 Response and contour diagram of the effect of liquid volume in flask, sodium chloride and corn saccharification liquid on γ-PGA yield

3 結(jié)論

傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造副產(chǎn)物之一黃水，其pH通常在3～4左右，氨味較重，經(jīng)過預(yù)處理：調(diào)整pH 7.0、稀釋8倍后，添加玉米糖化液濃度75 g/L（按可溶性固形物含量計），牛肉粉濃度7 g/L，谷氨酸鈉濃度40 g/L，NaCl 濃度12 g/L，K2HPO4濃度6 g/L，可以作為基質(zhì)發(fā)酵合成γ-PGA，在接種量1%（v/v），裝液量25 mL/250 mL，37 ℃發(fā)酵72 h，γ-PGA產(chǎn)量達(dá)14.510 g/L，由此可見，黃水基質(zhì)微生物發(fā)酵合成γ-PGA是可行的。黃水基質(zhì)γ-PGA發(fā)酵液可以直接作為農(nóng)業(yè)根部肥或者葉面肥使用，也可以作為果蔬保鮮處理劑；同時也可以提取精制后，作為食品添加劑等應(yīng)用于各個領(lǐng)域，具有較好的發(fā)展前景。