貯藏時(shí)間對(duì)雅安藏茶中活性成分及其抗氧化活性的影響

向卓亞，夏 陳，朱永清，羅棵瀕，鄧俊琳，陳 建, ，施劉剛

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川成都 610066；2.雅安市雅州恒泰茶業(yè)有限公司，四川雅安 625100）

雅安藏茶作為典型的黑茶產(chǎn)品，距今已有1300多年的歷史，被譽(yù)為藏族同胞的民生之茶[1]。藏茶屬后發(fā)酵茶，是以一芽五葉以內(nèi)的茶樹新梢為原料，經(jīng)過(guò)殺青、揉捻、渥堆、干燥等工序制成，在渥堆過(guò)程中多酚類化合物有大幅度的變化，以茶多酚為主的內(nèi)含成分發(fā)生氧化縮合，生成更復(fù)雜的化合物如茶褐素等產(chǎn)物，對(duì)藏茶的品質(zhì)具有重要作用[2?3]。基于藏茶中多種活性成分，研究發(fā)現(xiàn)藏茶具有減肥降脂、抗氧化、助消化和調(diào)理腸胃、降血糖、降尿酸等生理功能[3?4]。

由于黑茶具有耐貯藏性，其陳放過(guò)程中將繼續(xù)發(fā)生以多酚類為主的一系列生化反應(yīng)，從而形成陳茶的風(fēng)味品質(zhì)。段紅星等[5]發(fā)現(xiàn)普洱茶隨存放時(shí)間的延長(zhǎng)，茶多酚、氨基酸和咖啡堿呈減少趨勢(shì)。張春泉[6]發(fā)現(xiàn)安茶中兒茶素與茶黃素含量隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。目前陳茶逐漸受到市場(chǎng)的追捧，年份較久的陳茶價(jià)格越高[7?8]。貯藏時(shí)間對(duì)雅安藏茶品質(zhì)的影響十分重要。到目前為止，貯藏時(shí)間對(duì)藏茶中主要活性成分影響尚未有系統(tǒng)全面的解釋，僅有學(xué)者對(duì)不同貯藏時(shí)間下藏茶滋味和風(fēng)味成分的變化做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，酯類、烯烴類及芳香類物質(zhì)的含量越高[9]。

基于此，本文選取了同一廠家、不同貯藏時(shí)間的雅安藏茶，對(duì)其茶色素、總多酚、總黃酮及其抗氧化活性變化情況進(jìn)行比較，以期為藏茶后期貯藏及消費(fèi)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏茶樣品 供試藏茶共計(jì)3個(gè)（Z1-Z3），均購(gòu)自于雅州恒泰茶業(yè)有限公司，常溫密封保存于濕度45%～60%的倉(cāng)庫(kù)中，茶箱離地離墻15 cm，樣品信息如表1所示，茶葉樣品經(jīng)粉碎、過(guò)40目篩，得到樣品粉末后密封?18 ℃保存?zhèn)溆茫桓Ａ址印⒁掖肌⒓状肌Ⅺ}酸、氯化鉀、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉 分析純，成都市科龍化工試劑廠；標(biāo)準(zhǔn)品：沒(méi)食子酸（GA）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、咖啡堿（CA）、表兒茶素（EC）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（CG）、沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）（純度≥98%），北京索萊寶科技有限公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SHA-B型恒溫振蕩器 常州金南儀器制造有限公司；TD-4Z型臺(tái)式低速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；Synergy HTX型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Gentrifuge 5180R型冷凍干燥機(jī)

表1 供試樣品來(lái)源信息Table 1 Sample source information

德國(guó)Eppendorf公司；UV-6100型紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀、DAD檢測(cè)器 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉提取液制備 參照Feng等[10]的方法略做修改，稱取1 g茶葉粉，加入8 mL 80%甲醇（含1%甲酸）40 ℃超聲提取30 min，8000 r/min離心15 min，將上清液倒出備用，殘?jiān)貜?fù)上述方法提取2次，合并3次提取液并定容至25 mL，即為茶葉提取液。

1.2.2 茶色素提取及測(cè)定 參照Huang等[11]的方法略作修改。準(zhǔn)確稱取3 g（以干基計(jì)）茶粉于125 mL沸水中提取10 min。將50 mL水提物用50 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取并振蕩5 min，得到4 mL乙酸乙酯層，用13 mL 95%乙醇定容至25 mL，得到溶液A（EA）。向25 mL乙酸乙酯層中加入25 mL 2.5%NaHCO3后振蕩30 s，靜止分層后，將4 mL乙酸乙酯層用95%乙醇定容至25 mL，得到溶液C（EC）。向2 mL水層中加入2 mL飽和草酸溶液和6 mL超純水，用95%乙醇（15 mL）定容至25 mL，得到溶液D（ED）。25 mL水提物用25 mL 2.5%NaHCO3振蕩3 min，2 mL水相加入2 mL飽和草酸溶液和6 mL超純水，用15 mL 95%乙醇定容，得到溶液B（EB）。以上溶液（EA、EB、EC、ED）在380 nm下測(cè)量吸光度，并以95%乙醇作為空白對(duì)照。

式中：EA、EB、EC、ED為在380 nm下測(cè)量吸光度值；TFs，茶黃素，g/100 g；TBs，茶褐素，g/100 g；TRs，茶紅素，g/100 g。

1.2.3 總多酚測(cè)定 參照Z(yǔ)hang等[12]方法略做修改，取20 μL茶葉提取液，向其加入20 μL福林酚試劑，混合均勻后靜置5 min，隨后加入160 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% Na2CO3溶液，室溫下避光反應(yīng)60 min后，在765 nm下測(cè)定混合液吸光值。以沒(méi)食子酸溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），吸光值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒(méi)食子酸線性回歸方程為：y=0.0058x+0.027，R2=0.999，線性范圍2～175 μg/mL。

1.2.4 總黃酮測(cè)定 參照羅磊等[13]的方法略做修改，取20 μL茶葉提取液，加入80 μL蒸餾水和10 μL 25%（m/v）NaNO2反應(yīng)6 min，隨后加入10 μL 10% AlCl3?6H2O反應(yīng)5 min后，加入30 μL 1 mol/L NaOH和100 μL蒸餾水，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以兒茶素溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），吸光值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。兒茶素線性回歸方程為：y=1.1832x+0.059，R2=0.994，線性范圍0～200 μg/mL。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 ABTS自由基清除能力測(cè)定 參照Cheng等[14]方法略做修改。取20 μL茶葉提取液，加入20 μL蒸餾水和160 μL ABTS溶液，混勻避光反應(yīng)6 min，于734 nm處測(cè)定吸光值。以水溶性VE的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），清除率為縱坐標(biāo)（y），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=12.895x+0.0363，R2=0.998，線性范圍為0.0～19.5 μg/mL。以Trolox當(dāng)量計(jì)算，測(cè)定結(jié)果以μg/g表示。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參照Tao等[15]方法略作修改。取40 μL 茶葉提取液，加90 μL 80%甲醇（含1%甲酸），再加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液混勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），清除率為縱坐標(biāo)（y），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.9472x?2.95，R2=0.996，線性范圍為5.94～95.00 μg/mL。以Trolox當(dāng)量計(jì)算，測(cè)定結(jié)果以μg/g表示。

1.2.6 多酚類化合物測(cè)定 茶葉提取液中多酚類化合物分析測(cè)定采用高效液相色譜法，參照鄧俊琳等[16]的方法稍作修改。將茶葉提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。色譜柱：Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相：1%甲酸-水溶液（A），乙腈（B），洗脫條件：0～2 min，B：5%～10%；2～10 min，B：10%～20%，10～15 min，B：20%～40%；15～17 min，B：40%～70%；17～20 min，B：70%～95%。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：分別取9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用甲醇溶解并定容至5 mL作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。以二倍稀釋法用甲醇將各標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，高效液相色譜待測(cè)。以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程如表2所示。

樣品中多酚單體的含量計(jì)算公式如下：多酚單體含量（μg/g）=待測(cè)液中多酚單體濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3），采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較方法進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶色素含量比較

茶色素是發(fā)酵過(guò)程中茶多酚氧化的主要產(chǎn)物，包括茶褐素類、茶黃素類和茶紅素類，其中茶褐素類是其主體成分。茶色素對(duì)湯色、滋味以及功能性質(zhì)有重要的影響。目前對(duì)于茶色素的研究多集中在普洱茶和紅茶方面[11,17?18]，而對(duì)藏茶中茶色素的研究較少。不同貯藏時(shí)間下藏茶中茶色素含量變化情況見表3。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，茶褐素含量持續(xù)顯著增加（P<0.05），而茶黃素含量持續(xù)顯著減少（P<0.05），貯藏10年后的藏茶中茶紅素開始顯著減少（P<0.05），這與甘甜等[9]的研究結(jié)果相一致。這可能由于后期貯藏過(guò)程中仍有部分多酚類物質(zhì)、茶黃素和茶紅素等進(jìn)一步氧化聚合成茶褐素，使其進(jìn)一步積累[19?20]。而茶黃素作為氧化聚合過(guò)程中的中間產(chǎn)物，一方面通過(guò)茶黃素氧化聚合進(jìn)一步累積，另一方面茶紅素又將繼續(xù)被氧化聚合而減少[21]。因此，雅安藏茶在貯藏過(guò)程中，茶色素變化的總趨勢(shì)是茶黃素和茶紅素顯著下降，茶褐素大量積累。張春泉[6]同樣發(fā)現(xiàn)安茶在陳化過(guò)程中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，茶褐素含量呈顯著的上升趨勢(shì)。目前研究發(fā)現(xiàn)茶褐素能降低肝臟脂肪酸合酶的活性，抑制肝臟合成脂肪，促進(jìn)體內(nèi)甘油三酯的降解[4]，因此陳化時(shí)間延長(zhǎng)利于藏茶中茶褐素進(jìn)一步積累，增強(qiáng)藏茶保健功能。

表2 多酚單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 The standard curve of polyphenol monomers

表3 不同貯藏時(shí)間藏茶中茶色素含量變化Table 3 Changes of pigment content in Tibetan tea during different storage time

2.2 總多酚、總黃酮及抗氧化活性比較

不同貯藏時(shí)間藏茶中總多酚、總黃酮及抗氧化活性的結(jié)果見表4。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，藏茶中總多酚和總黃酮顯著降低（P<0.05）。其含量顯著降低可能有以下幾個(gè)方面原因：其一，酚類物質(zhì)性質(zhì)極其活潑，貯藏過(guò)程極易發(fā)生氧化作用，從而繼續(xù)氧化聚合生成新的化學(xué)物質(zhì)；其二，貯藏過(guò)程在微生物作用下產(chǎn)生各種酸性物質(zhì)，使兒茶素等被降解；其三，酚類物質(zhì)被在酶的作用下被降解為可被微生物利用的碳源[22]。薛晨[23]對(duì)不同貯藏時(shí)間普洱茶中主要化學(xué)成分研究表明，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，茶葉中的多酚類自動(dòng)氧化加深，多酚類含量降低。而張春泉[6]研究發(fā)現(xiàn)不同年代的安茶中總多酚含量并無(wú)顯著差異，這可能與安茶中的茶多酚類物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。藏茶中多酚類化合物使其表現(xiàn)出生物活性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基清除能力來(lái)評(píng)價(jià)不同貯藏時(shí)間下藏茶的抗氧化性，結(jié)果顯示DPPH 試驗(yàn)和ABTS 試驗(yàn)的結(jié)果較一致，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH自由基清除能力顯著減弱（P<0.05），而貯藏10年后ABTS自由基清除能力也顯著減弱（P<0.05），本實(shí)驗(yàn)中抗氧化活性隨著貯藏時(shí)間的變化趨勢(shì)與總多酚和總黃酮的變化趨勢(shì)也基本一致，這表明醇提液的抗氧化活性與總多酚和總黃酮含量有密切關(guān)聯(lián)。

2.3 多酚類化合物含量比較

多酚類化合物是藏茶品質(zhì)的重要活性成分，其含量變化對(duì)品質(zhì)的形成具有十分重要的作用。其中C和GA是茶葉中多酚類物質(zhì)的重要成分，C是茶多酚的主體成分，其含量與茶葉品質(zhì)有密切關(guān)系[24]。GA是茶多酚的重要組成單元，常與兒茶素的酚羥基以酯的形式連接，形成一系列酯型兒茶素衍生物[25]。而咖啡堿是茶葉苦味的主要呈味物質(zhì)[26]。不同貯藏時(shí)間下藏茶中多酚類化合物含量變化見表5，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，藏茶中C和兒茶素單體（EGC、CG、ECG、EGCG、EC）含量顯著降低而GA含量顯著增加（P<0.05）。這可能由于藏茶在長(zhǎng)期存放過(guò)程中，多酚類化合物發(fā)生氧化聚合形成茶黃素和茶紅素等成分，同時(shí)使得GA發(fā)生脫落導(dǎo)致其含量顯著增加[22]。越陳的藏茶中CA含量雖越低（P<0.05），但變化幅度較小，這可能與咖啡堿性質(zhì)穩(wěn)定、自身不容易降解和氧化有關(guān)。劉澤森等[27]同樣發(fā)現(xiàn)不同年份的六堡茶中咖啡堿含量變化無(wú)明顯趨勢(shì)。

表4 不同貯藏時(shí)間藏茶中總多酚、總黃酮及抗氧化活性變化Table 4 Changes of total polyphenols, total flavones and antioxidant activity in Tibetan tea during different storage time

表5 不同貯藏時(shí)間藏茶中多酚類化合物含量變化Table 5 Changes of polyphenols in Tibetan tea during different storage time

表6 藏茶中總多酚、總黃酮、多酚化合物、茶色素和抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of total polyphenols, total flavones, polyphenol compounds, tea pigments and antioxidant activities in Tibetan tea

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 多酚類化合物之間相關(guān)性分析 通過(guò)對(duì)不同貯藏時(shí)間藏茶中多酚類化合物的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TBs與總多酚、總黃酮、C、CA、CG呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與EGC、EC、EGCG、ECG、TFs以及TRs呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。研究表明TBs是多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物，主要由兒茶素在多酚氧化酶等酶作用下氧化形成鄰醌，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)氧化縮聚形成TFs和TRs，再進(jìn)一步氧化聚合形成TBs[28]。這與凌萌樂(lè)等[29]發(fā)現(xiàn)普洱茶中茶褐素含量與茶多酚和兒茶素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)結(jié)論相一致。

2.4.2 多酚類化合物與抗氧化活性相關(guān)性分析 由表6可知，通過(guò)對(duì)多酚類化合物與抗氧化活性等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析可證實(shí)ABTS自由基清除能力與藏茶中總多酚、總黃酮呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P<0.01），與EGC、C、CA、EC、EGCG、ECG、TFs、TRs呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與DPPH自由基清除能力也具有極顯著正相關(guān)（P<0.01）（見表6）。此外，向麗敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)茶葉抗氧化活性影響最大的是總多酚含量，接下來(lái)依次為總黃酮含量、茶黃素、茶紅素、茶褐素。

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)不同貯藏時(shí)間藏茶中茶色素、總多酚、總黃酮、多酚類化合物以及抗氧化活性的分析比較，發(fā)現(xiàn)不同年份的藏茶中主要活性成分含量、抗氧化能力相差較大，其中陳化時(shí)間越久，藏茶中總多酚、總黃酮以及兒茶素類化合物含量越低，而茶褐素含量越高。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)三個(gè)貯藏時(shí)間段藏茶進(jìn)行分析比較，未來(lái)可進(jìn)一步延長(zhǎng)貯藏時(shí)間，更加全面對(duì)陳化藏茶活性成分及抗氧化活性進(jìn)行比較研究，以期為陳年藏茶的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。