白藜蘆醇調控miR-491抑制胃癌細胞增殖和遷移

卞麗霞 劉佩 黃雯 俞軍 蒲加澤

胃癌(gastric cancer)是全球范圍內癌癥導致死亡的第三大原因[1]。據中國國家癌癥中心統計數據，胃癌已成為中國第二大常見癌癥，2015年約有498 000例患者死亡[2]，而且大多數患者被診斷時已是晚期，導致胃癌患者的5年生存率<25%[3]。許多植物中的化學物質會對癌癥產生一定的抑制作用，白藜蘆醇(Resveratrol，RES)就是其中之一。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，是許多植物受到外界刺激后產生的一種抗毒素，白藜蘆醇除對衰老[4,5]、糖尿病[6,7]、心血管疾病[7]等有作用外，還對肺癌[8]、前列腺癌[9]、肝癌[10]、胃癌[11]等癌癥有一定的抗瘤活性。MicroRNA(miRNA，miR)是長度為18～25個核苷酸的非編碼短RNA分子，在人類癌癥的發生和發展中起著重要的作用，而且有可能被用作癌癥的潛在治療靶點[12]。據研究報道，有多種miRNA參與了癌癥的發生和發展，且部分miRNA也可以作為癌癥診斷的分子標志物[13,14]。miR-491在多種癌癥中能夠調節癌細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲和耐藥性[15,16]，且miR-491對胃癌細胞也有一定的抑制作用[17,18]。

1 材料與方法

1.1 細胞 人胃癌細胞株SGC-7901和人胃上皮細胞株GES-1購于中國科學院(上海)細胞庫。

1.2 試劑與主要儀器 Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑盒、Trizol試劑盒均購于賽默飛；TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒購于連橋生物科技有限公司；SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒購于瑞諾德生物科技有限公司；DMEM培養基購于科敏生物科技有限公司。Thermo酶標儀購于益奧柏科貿有限公司；Smartzoom 5顯微鏡購于普瑞賽斯儀器有限公司。

1.3 細胞培養 胃癌細胞株SGC-7901和胃上皮細胞株GES-1在37℃、5% CO2的條件下置于含有10%FCS的DMEM培養基中培養，用于后續實驗。

1.4 細胞轉染 SGC-7901細胞在DMEM培養基中培養至細胞融合80%左右時進行轉染。SGC-7901細胞以5×104個/孔的密度接種于96孔板，按照脂質體轉染試劑盒說明書將上海吉瑪公司設計并合成的脂質體轉染至SGC-7901細胞中，轉染脂質體48 h后檢測轉染效率并進行后續實驗。

1.5 細胞增殖實驗 SGC-7901細胞以5×104個/孔的密度接種于96孔板，對細胞進行相應處理后使用CCK-8檢測試劑盒檢測各組細胞的增殖活力，使用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光光度值，每組設置3個復孔并設置空白對照。

1.6 細胞遷移實驗 將各組細胞以2×104個/室的密度接種于包覆有Matrigel基質膠的Transwell小室上室，在下室中加入含有10%FCS的DMEM培養基作為引誘劑。24 h后擦拭掉上室未發生遷移的細胞，使用4%多聚甲醛固定下室中的細胞并使用0.1%的結晶紫染色。顯微鏡下隨機選擇5個視野進行計數。

1.7 qRT-PCR實驗 使用Trizol試劑盒提取SGC-7901細胞內的總RNA，使用TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒逆轉錄RNA，使用SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒進行實時定量PCR反應，反應條件為：95℃，5 min；95℃，20 s；60℃，30 s。此過程共進行40個循環。所有引物均由上海吉瑪公司設計合成。見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 白藜蘆醇對SGC-7901細胞增殖和遷移的影響 CCK-8實驗檢測白藜蘆醇處理后胃癌SGC-7901細胞的增殖活力變化情況。白藜蘆醇濃度>50 μmol/L時，SGC-7901細胞的增殖活力受到顯著抑制(P<0.05)；隨白藜蘆醇濃度增加，SGC-7901細胞的增殖活力受到的抑制也顯著增加。Transwell實驗檢測結果顯示，白藜蘆醇(50 μmol/L)處理后SGC-7901細胞的遷移能力受到顯著抑制(P<0.001)。見表2，圖1。

表2 白藜蘆醇對SGC-7901細胞遷移數目的影響 個,

圖1 白藜蘆醇抑制SGC-7901細胞增殖和遷移;A SGC-7901細胞增殖活力;B SGC-7901細胞遷移能力

2.2 白藜蘆醇對miR-491表達的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，相較于GES-1細胞，胃癌SGC-7901細胞內miR-491的表達量顯著降低(1.00±0.04 vs 0.57±0.04，P<0.001)；SGC-7901經過白藜蘆醇(50 μmol/L)處理后，細胞內miR-491的表達量顯著上調(1.00±0.03 vs 1.52±0.03，P<0.001)。

2.3 miR-491影響SGC-7901增殖和遷移 qRT-PCR檢測結果顯示，轉染miR-491 mimics脂質體的SGC-7901細胞內miR-491的表達相較于轉染miR-NC脂質體的SGC-7901細胞顯著上調(1.00±0.01 vs 1.62±0.06，P<0.001)。CCK-8實驗結果顯示，轉染miR-491 mimics脂質體后，SGC-7901細胞的增殖活力相較于轉染miR-NC脂質體的SGC-7901細胞受到顯著抑制(P<0.05)。Transwell實驗結果顯示，相較于轉染miR-NC脂質體的SGC-7901細胞，轉染miR-491 mimics脂質體的SGC-7901細胞遷移能力受到顯著抑制(P<0.001)。見表3，圖2。

表3 miR-491對SGC-7901細胞遷移數目影響

圖2 miR-491影響SGC-7901增殖和遷移;A miR-491增殖活力;B SGC-7901遷移能力

3 討論

白藜蘆醇最早是從白藜蘆根部分離出的多酚化合物，目前在桑葚、葡萄、花生等植物中也有發現[19,20]。有文獻報道，白藜蘆醇具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗哮喘的作用[7,20,21]。CCK-8和Transwell實驗證實，一定劑量的白藜蘆醇對胃癌SGC-7901的增殖和遷移都有一定的抑制作用，與已報道的結果一致。miR-491在乳腺癌、胃癌、肺癌和結直腸癌等癌癥[22,23]中起重要的抑癌作用。qRT-PCR實驗發現miR-491在胃癌SGC-7901細胞中的表達顯著下調，且SGC-7901中miR-491的表達量在經過白藜蘆醇的處理后顯著上調。轉染miR-491 mimics脂質體后，胃癌SGC-7901細胞的增殖和遷移都受到一定的抑制作用。表明白藜蘆醇有可能通過上調miR-491的表達來抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖和遷移。

據報道，miRNA影響癌癥的發生和發展主要是通過調控下游靶基因的表達來實現的[24]。ENCORI數據庫的預測結果顯示，miR-491存在5373個可能的下游靶基因，Wang等[25]研究表明，miR-491可以通過靶向CRYAB抑制骨肉瘤的轉移并增強其化療敏感性。通過查閱文獻得知，非洲爪蟾驅動蛋白樣蛋白2(TPX2)的表達與胃癌的預后相關[26]，而且分析發現TPX2也是miR-491的下游靶基因之一，因此我們推測白藜蘆醇對胃癌SGC-7901增殖和遷移的抑制作用有可能是通過miR-491/TPX2分子軸實現的，但這需要進一步研究。