急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1與pro-BNP的表達水平及意義

周秀 廖曉現 成力

心力衰竭主要是由于心臟結構或功能異常從而促使心室充盈或損傷射血功能的損傷心肌后誘導心肌細胞凋亡，最終導致心室重構的復雜綜合征[1]。急性心力衰竭是指心衰的癥狀和體征迅速發生或惡化，急性缺血性心力衰竭主要是由于心肌收縮力不足而顯著降低心排血量時出現左心室舒張末壓升高伴隨癥從而致使肺部周圍循環不足造成肺部淤血的一組臨床綜合征[2]。急性缺血性心力衰竭患者無特異性臨床表現，以往常依據患者臨床癥狀體征判斷疾病程度，不具客觀性，心臟彩超檢查可提供一定的客觀指標，但仍具有局限性，因此需尋找一些特異性生物標志物用于診斷疾病及評估預后情況。血清腦利鈉肽前體(pro-brain natriuretic peptide，pro-BNP)作為于人體心室內合成的一種多肽類物質，心力衰竭發生時促使其加快合成與分泌從而提高自身表達水平，臨床常以pro-BNP評估患者心功能及預后，但其表達水平與疾病嚴重程度并非均呈正相關關系且具有不穩定性[3]。研究表明鈣整合素結合蛋白1(calcium-and intergtin-binding protein，CIB1)分布于生物體內心、肺等各種組織器官，可通過參與細胞增殖、遷移及血管形成等過程進而調控心臟等組織器官中各種病理變化過程[4]。因此，本研究主要探討急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA、蛋白與pro-BNP表達水平及其在臨床診斷與評估患者預后中的重要應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月至2018年11月于重慶市開州區人民醫院診治的急性缺血性心力衰竭患者120例為研究組，其中男62例，女58例；年齡45～75歲，平均年齡(62.54±5.19)歲；美國紐約心臟病協會(New York Heart Association，NYHA)心功能分級：Ⅰ級時不影響患者正常生活(本研究中對此不做深入研究)；Ⅱ級時患者體力活動受限并出現心衰癥狀；Ⅲ級時患者低于一般活動時引起心衰癥狀；Ⅳ級時患者不能從事任何活動且休息時也存在心衰癥狀[5]。根據NYHA心功能分級將研究組患者分為Ⅱ級、Ⅲ級與Ⅳ級組，每組40例，另以同期健康體檢者40例為對照組，其中男21例，女19例；年齡43～72歲，平均年齡(61.79±5.26)歲。2組患者臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合急性缺血性心力衰竭診斷標準[6]；②所有受試對象知曉本研究內容且簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①急性心肌梗死者；急性炎癥者；②惡性腫瘤者；③不穩定心絞痛者；④嚴重高血壓患者；⑤自身免疫性疾病者。

1.3 主要儀器與試劑 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀與NanoDrop 2000超微量核酸測定儀均購自美國Thermo公司，Trizol試劑及RNA反轉錄試劑盒均購自北京恩碩生物科技有限公司。SYBR Green qRT-PCR試劑盒選購于天根生化科技(北京)有限公司，CIB1 mRNA及內參基因β-actin引物均由生工生物(上海)工程有限公司合成。

1.4 研究方法

1.4.1 qRT-PCR法檢測血清CIB1 mRNA表達水平:收集研究組與對照組空腹靜脈血標本3 ml，離心后提取上清，按照Trizol試劑盒操作方法提取血清總RNA，按照RNA反轉錄試劑盒將其反轉為cDNA，qRT-PCR法檢測血清CIB1 mRNA表達水平。CIB1 mRNA上游序列為5’-CACGGCTTAGTGCGTCTGAG-3’，下游序列為5’-AAAGTCTGGAGAACGGGAGAT-3’。β-actin為內參基因，上游序列為5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，下游序列為5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’。qRT-PCR反應體系為20 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O 6 μl。將其放進速凍離心機混勻后放入熒光定量PCR儀，設置程序為95℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共進行42個循環，72℃延伸10 min。反應結束后將數據保存并對所得數據Ct值進行分析，采用2-ΔΔCt算法計算CIB1 mRNA相對表達量。

1.4.2 蛋白免疫印跡法檢測CIB1蛋白表達情況:采用蛋白免疫印跡法以β-actin蛋白作為內參，檢測研究組與對照組血清CIB1蛋白表達水平，按照操作說明進行檢測，采用Tanon軟件拍攝圖像并對蛋白表達水平進行半定量分析。

1.4.3 檢測血清pro-BNP表達水平:采集研究組與對照組空腹靜脈血標本3 ml，離心后提取上清，采用全自動電化學發光免疫分析儀及試劑盒進行檢測(羅氏公司)血清pro-BNP表達水平。

1.4.4 研究組臨床特征:檢測研究組患者左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)水平，并統計胸腔積液、心房顫動發生例數。

1.5 隨訪 對研究組患者進行門診復查、電話方式隨訪6個月，記錄患者隨訪期間發生心源性再住院及死亡情況，以心源性再住院或死亡為終點事件，屬于預后不良。

2 結果

2.1 4組血清CIB1 mRNA及蛋白、pro-BNP表達水平比較 研究組(Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級組)血清CIB1 mRNA及蛋白表達水平低于對照組，且Ⅳ級組血清CIB1 mRNA及蛋白表達水平低于Ⅱ級組與Ⅲ級組；研究組血清pro-BNP表達水平高于對照組，且Ⅳ級組血清pro-BNP表達水平高于Ⅱ級組與Ⅲ級組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 4組血清CIB1 mRNA及蛋白、pro-BNP表達水平比較

圖1 4組血清CIB1蛋白表達印跡

2.2 急性缺血性心力衰竭患者臨床特征比較 Ⅱ級組、Ⅲ級組、Ⅳ級組患者LVEF水平依次降低(P<0.05)，LVEDD、PAH水平依次升高(P<0.05)；Ⅳ級組胸腔積液患者比例高于Ⅱ級組(P<0.05)；3組心房顫動患者比例比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 急性缺血性心力衰竭患者臨床特征比較 n=40

2.3 急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA、pro-BNP表達水平與臨床特征的關系 Ⅱ級組患者血清CIB1 mRNA表達水平與LVEF、胸腔積液均呈正相關(r=0.360、0.367,P<0.05)，血清pro-BNP表達水平與LVEF呈負相關(r=-0.460,P<0.05)。Ⅲ級組患者血清CIB1 mRNA表達水平與LVEF呈正相關(r=0.362,P<0.05)，血清pro-BNP表達水平與LVEF呈負相關(r=-0.374,P<0.05)。Ⅳ級組患者血清CIB1 mRNA表達水平與LVEF、LVEDD、PAH、胸腔積液均呈正相關(r=0.379、0.468、0.380、0.375,P<0.05)，血清pro-BNP表達水平與LVEF呈負相關，與LVEDD、PAH、胸腔積液均呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA、pro-BNP表達水平與臨床特征的相關性(r/P)

2.4 影響急性缺血性心力衰竭患者預后的因素分析 對患者進行隨訪，期間發生心源性再住院26例(21.67%)，死亡11例(9.17%)，共發生終點事件37例。以患者預后情況為因變量，以上述檢測指標為自變量進行COX回歸分析，結果顯示CIB1 mRNA、pro-BNP、LVEF與PAH是影響急性缺血性心力衰竭患者預后的危險因素。見表4。

表4 影響急性缺血性心力衰竭患者預后的單因素與多因素分析

2.5 急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達水平的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達水平呈顯著負相關(r=-0.512，P=0.027)。見圖2。

圖2 急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達水平相關性分析

3 討論

心力衰竭發病率隨著心血管疾病發病率的升高而呈持續升高的趨勢，若不及時診治，則危及患者生命。急性缺血性心力衰竭是多種心血管疾病的共同最終表現形式，主要表現為心肌損傷、心臟結構重構和心功能的變化[7]。目前，臨床多采用超聲心動圖檢查得到心臟彩超參數用于診斷疾病發生情況，但不能準確診斷急性缺血性心力衰竭患者的疾病嚴重程度[8]。近來，研究表明血液學指標不僅可用于檢測各類心力衰竭等心血管疾病，同時能夠及時評價療效從而有利于及時調整治療方案[9]。

pro-BNP是一種有心室內合成與分泌的多肽類物質，不僅有利于血管擴張，同時可有效反應心血管疾病的狀態[10]。研究表明pro-BNP可用于診斷心力衰竭、冠心病等心血管疾病，其表達水平愈高可反應疾病愈嚴重，同時pro-BNP表達水平與患者預后情況緊密相關，但其對疾病嚴重程度診斷具有不穩定性[3]。CIB1是一個位于15號染色體22 kD的活性調節蛋白，可通過與不同蛋白結合從而影響鈣信號傳遞、DNA修復、細胞凋亡等過程[11]。研究表明，在腫瘤發生發展過程中CIB1對其內皮細胞及癌細胞增殖中發揮重要作用[12]。此外，CIB1可通過調節AKT通路進而促使肝癌細胞、神經母細胞瘤及乳腺癌細胞的增殖[13]。CIB1不僅與腫瘤發生具有密切關系，同時可特異性地參與細胞分裂、血管發生等過程[14]。有研究顯示，CIB1可促使缺血性p21激活酶1活化，從而調節血管內皮細胞功能并促使血管形成[15]。本研究結果顯示急性缺血性心力衰竭患者體內血清pro-BNP表達水平高于對照組，且Ⅳ級組高于Ⅱ級組與Ⅳ級組，而血清CIB1 mRNA及蛋白表達水平低于對照組，且Ⅳ級低于Ⅱ級組與Ⅳ級組，說明隨著急性缺血性心力衰竭患者病情加重，體內血清pro-BNP表達水平逐漸升高，而血清CIB1 mRNA表達水平降低，這可能是由于CIB1 mRNA表達降低并抑制心血管中細胞的存活或增殖從而影響血管生成造成心肌缺血。Western法檢測CIB1蛋白表達結果顯示其蛋白相對表達水平顯著低于對照組，Ⅳ級組患者顯著低于Ⅱ級、Ⅲ級組，說明急性缺血性心力衰竭疾病嚴重程度不同，患者CIB1蛋白表達也隨之不同，且不同等級間具有明顯差異，推測CIB1蛋白表達水平可預測該病的疾病嚴重程度。

急性缺血性心力衰竭患者Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級組LVEF逐漸降低，而LVEDD、PAH及胸腔積液比例逐漸增加，表明隨著患者病情嚴重程度的增加，心功能明顯下降，且發生胸腔積液風險性也隨之增加。本研究進一步分析顯示血清pro-BNP表達水平均與LVEF呈負相關，血清CIB1 mRNA表達水平均與LVEF呈正相關，LVEDD、PAH及胸腔積液均與Ⅳ級組血清CIB1 mRNA、pro-BNP表達水平呈正相關，說明臨床診療急性缺血性心力衰竭時檢測血清CIB1 mRNA、pro-BNP表達可有效預判疾病發生發展進程。Pearson相關性分析結果顯示急性缺血性心力衰竭患者血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達水平呈顯著負相關，進一步說明血清CIB1 mRNA與pro-BNP在患者體內相互影響，推測二者可作為預測急性缺血性心力衰竭的生物學指標。另對患者進行隨訪，期間發生終點事件心源性再住院及死亡共37例，采用COX單因素及多因素回歸分析，結果顯示CIB1 mRNA、pro-BNP、LVEF與PAH是影響急性缺血性心力衰竭患者預后的危險因素。說明血清CIB1 mRNA與pro-BNP表達水平可有效評估患者預后情況，同時臨床也應密切監測LVEF與PAH水平變化情況，對重點人群進行隨訪，以最大程度改善患者預后，降低患者經濟成本。

綜上所述，血清CIB1 mRNA、蛋白與pro-BNP表達水平可作為預測急性缺血性心力衰竭的生物學指標，二者對臨床診療及病情評估具有重要價值，且能夠作為評估患者預后的重要指標。本研究也存在不足之處，針對二者具體的分子調節機制有待進一步研究。