miR-214-5p靶向SEMA4C基因調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制

董寶鐵 李泓 高偉 周振東

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種侵蝕軟骨和骨的慢性炎癥性自身免疫性疾病，確切發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，是一個致殘率較高的疾病，其主要病理特征是滑膜炎，RA滑膜成纖維細(xì)胞(RA-FLSs)是RA滑膜增生和侵襲的主要效應(yīng)細(xì)胞，也是治療的靶細(xì)胞[1]。有研究表明，在大鼠RA模型細(xì)胞中注射miRNA模擬物或siRNA，可減輕RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹和關(guān)節(jié)炎指數(shù)，抑制RA-FLSs增殖和炎性反應(yīng)[2]。有研究表明，與無RA的間質(zhì)性肺病(ILD)患者相比，miR-214-5p在RA相關(guān)的ILD患者中表達(dá)上調(diào)[3]。miR-214-5p在前列腺癌和胰腺癌中表達(dá)均下調(diào)，與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲相關(guān)[4,5]。starBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SEMA4C與miR-214-5p存在互補(bǔ)的位點。SEMA4C在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，可導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲和遷移率的增加[6]。SEMA4C在RA中的表達(dá)及其與miR-214-5p的關(guān)系目前尚不清楚。本研究以RA患者關(guān)節(jié)置換術(shù)取出的滑膜組織中分離培養(yǎng)的RA-FLSs為研究對象，假設(shè)miR-214-5p靶向SEMA4C影響RA-FLSs細(xì)胞增殖和侵襲，并對此進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料 人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織取自我院行關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者；告知患者其滑膜組織的用途，與患者簽署知情同意書，RA患者的臨床診斷特征均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，牛血清白蛋白(Bovine Serun Albumin,BSA)和胰蛋白酶Trypsin(美國Sigma-Aldrich公司)；Transwell板(美國Corning公司)；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(美國Promega公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Total RNA提取試劑盒、real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)(美國Invitrogen公司)；SEMA4C抑制劑(si-SEMA4C)、SEMA4C過表達(dá)載體pcDNA-SEMA4C、miR-214-5p的模擬物(miR-214-5p)、miR-214-5p的干擾物(anti-miR-214-5p)、陰性對照(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC、pcDNA-NC)和引物購自上海吉瑪制藥有限公司；CCK8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白檢測試劑盒(Thermo)；SEMA4C、CyclinD1、MMP-2、MMP-9抗體和β-actin抗體(美國Santa cruz公司)；全自動酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):清洗從RA患者關(guān)節(jié)置換術(shù)取出的滑膜組織，用無菌剪剪碎，然后在0.25%胰酶中37℃消化2 h，離心收集細(xì)胞，即RA-FLSs細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。消化傳代，實驗選用第3～8代細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將對數(shù)生長期的RA-FLSs細(xì)胞稀釋至1×106個/ml，以2×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至基本融合為一層時按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：miR-NC組、miR-214-5p組、si-NC組、si-SEMA4C組、anti-miR-NC組、anti-miR-214-5p組、miR-214-5p+pcDNA-NC組和miR-214-5p+pcDNA-SEMA4C組。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.3 Real-time PCR檢測miR-214-5p和SEMA4C mRNA的表達(dá):收集RA-FLSs細(xì)胞，用試劑盒提取總RNA，保存于-80℃。然后按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)程序為16℃ 30 min、42℃ 40 min、72℃ 5 min；4℃放置10 min，于-80℃保存。取cDNA按照 Real-time PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 45 s、60℃ 50 s、72℃ 45 s，40個循環(huán)；72℃10 min。引物如下：miR-214-5p 上 游：5’-TCTCTTGCTATAGAAGCACAAC-3’，下游：5’-TCCTCCACAATCATGCTGTGT-3’；SEMA4C上游：5’-ACCTTGTGCCGCGTAAGACAG-3’，下游：5’-CGTCAGCGTCAGTGTCAGGAA-3’。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 Western Blot實驗:收集對數(shù)生長期的RA-FLSs細(xì)胞，裂解細(xì)胞，收集蛋白并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入稀釋的一抗SEMA4C、CyclinD1、MMP-2和MMP-9，4℃過夜孵育。洗膜，加入500倍稀釋的二抗，室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.3.5 CCK8實驗檢測細(xì)胞活性:收集轉(zhuǎn)染后的RA-FLSs細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，稀釋細(xì)胞，以2×103個細(xì)胞/孔(100 μl)接種于96微孔板中，繼續(xù)48 h，進(jìn)行 CCK8實驗，每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.3.6 Transwell實驗測定細(xì)胞侵襲:將Matrigel置4℃過夜融化，以4℃無血清DMEM培養(yǎng)基1∶6比例稀釋Matrigel，取100 μl均勻鋪滿上層Transwell小室，37℃固化3 h，Transwell上層小室加入100 μl RA-FLSs細(xì)胞(2×106個/ml)，下層小室加入500 μl 20%FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，冰甲醛固定侵襲細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察計數(shù)。

1.3.7 雙熒光素酶報告實驗:根據(jù)方法1.3.2進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建SEMA4C的野生型(WT-SEMA4C)和突變型(MUT-SEMA4C)雙熒光素酶報告載體，分別于miR-NC或miR-214-5p共轉(zhuǎn)染RA-FLSs，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞上清，發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 RA-FLSs中miR-214-5p和SEMA4C的表達(dá) qRT-PCR和Western Blot結(jié)果表明，與對照組比較，RA-FLSs組中miR-214-5p的含量下降，SEMA4C mRNA和蛋白水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 miR-214-5p和SEMA4C在RA-FLSs中的表達(dá)情況

圖1 Western Blot檢測SEMA4C蛋白表達(dá)

2.2 高表達(dá)miR-214-5p對RA-FLSs細(xì)胞增殖和侵襲的影響 qRT-PCR結(jié)果表明，與miR-NC組比較，miR-214-5p組的miR-214-5p表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。CCK8和Transwell實驗結(jié)果表明，與miR-NC組比較，miR-214-5p組的RA-FLSs細(xì)胞增殖率和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明上調(diào)miR-214-5p可抑制RA-FLSs的增殖和侵襲。見表2，圖2。

表2 高表達(dá)miR-214-5p對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs增殖和侵襲的影響

圖2 Western Blot檢測CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

2.3 低表達(dá)SEMA4C對RA-FLSs細(xì)胞增殖和侵襲的影響 Western Blot、CCK8和Transwell實驗結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-SEMA4C組SEMA4C表達(dá)水平降低，RA-FLSs細(xì)胞增殖率和侵襲細(xì)胞數(shù)均下降，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明低表達(dá)SEMA4C可以抑制RA-FLSs細(xì)胞增殖和侵襲。見圖3，表3。

圖3 Western Blot檢測SEMA4C、CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)

表3 低表達(dá)SEMA4C對RA-FLSs增殖和侵襲的影響

2.4 miR-214-5p靶向SEMA4C starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，SEMA4C的3’-UTR序列中含有與miR-214-5p互補(bǔ)的位點。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-214-5p組野生型WT-SEMA4C的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)；而突變型MUT-SEMA4C的螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化(P>0.05)。Western Blot結(jié)果表明，與miR-NC組比較，miR-214-5p組的SEMA4C蛋白水平下降(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-214-5p組的SEMA4C蛋白水平上升(P<0.05)。見圖4，表4、5。

圖4 miR-214-5p靶向調(diào)控SEMA4C表達(dá);A starbase對miR-214-5p和SEMA4C結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖；B Western Blot檢測SEMA4C表達(dá)量

表4 miR-NC或miR-214-5p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RA-FLSs細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 Western Blot檢測SEMA4C的表達(dá)

2.5 高表達(dá)SEMA4C可以逆轉(zhuǎn)miR-214-5p對RA-FLSs增殖和侵襲的影響 Western Blot、CCK8和Transwell結(jié)果顯示，與miR-214-5p+pcDNA-NC組比較，miR-214-5p+pcDNA-SEMA4C組RA-FLSs細(xì)胞中SEMA4C表達(dá)水平增高，RA-FLSs細(xì)胞增殖率和侵襲細(xì)胞數(shù)均增高，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明高表達(dá)SEMA4C逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-214-5p對RA-FLSs細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。見圖5，表6。

圖5 Western Blot檢測SEMA4C、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

表6 高表達(dá)SEMA4C可以逆轉(zhuǎn)miR-214-5p對RA-FLSs增殖和侵襲的影響

3 討論

近年來，使用有效的生物制劑和新藥物的靶向治療方法極大改善了RA患者痛苦[7]。研究證實，RA-FLSs的表觀遺傳學(xué)改變(DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA表達(dá))在關(guān)節(jié)炎癥和損傷中起重要作用[8]。許多miRNAs在RA患者的細(xì)胞、組織和體液中的表達(dá)也發(fā)生了改變，miRNA類似物或拮抗劑已被用作實驗性關(guān)節(jié)炎模型的治療方案，并顯示出良好的效果，為RA患者提供了發(fā)現(xiàn)新的靶向藥物的機(jī)會[9]。但仍有部分miRNA在RA-FLSs增殖及凋亡中的作用機(jī)制尚未完全闡明。

研究表明，miR-214在強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎中和腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的RA患者T細(xì)胞中均呈現(xiàn)低表達(dá)[10,11]，且miR-214的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了TNF-α介導(dǎo)的RA-T細(xì)胞凋亡，抑制了細(xì)胞內(nèi)ERK和JNK的磷酸化。miR-214-5p在RA-FLSs的表達(dá)和具體作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，miR-214-5p在RA-FLSs中表達(dá)量顯著下調(diào)，提示miR-214-5p在RA-FLSs中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示高表達(dá)miR-214-5p可抑制RA-FLSs細(xì)胞增殖和侵襲，抑制CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，研究表明CyclinD1可正向調(diào)控細(xì)胞周期，并可與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]。基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲密切相關(guān)，MMP2、MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶類并可促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲[13]。本研究結(jié)果提示miR-214-5p過表達(dá)可抑制RA-FLSs細(xì)胞增殖及侵襲，從而在RA-FLSs中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

此外，通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SEMA4C的3’-UTR序列中含有與miR-214-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，預(yù)示兩者間存在結(jié)合位點。本研究假設(shè)miR-214-5p可靶向SEMA4C調(diào)控RA-FLSs的增殖和侵襲。SEMA4C又叫信號素分子4C，SEMA4C在喉鱗狀細(xì)胞癌組織、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織、宮頸癌和骨肉瘤中均表達(dá)上調(diào)，與癌細(xì)胞的EMT、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，是多個miRNA的靶點，發(fā)揮癌基因的作用[14-17]。SEMA4C在RA-FLSs細(xì)胞中表達(dá)尚不清楚。本研究證實，SEMA4C在RA-FLSs中的表達(dá)量升高，低表達(dá)SEMA4C基因可顯著抑制RA-FLSs細(xì)胞增殖和侵襲。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-214-5p靶向負(fù)調(diào)控SEMA4C蛋白表達(dá)，提示miR-214-5p可能通過負(fù)向調(diào)控SEMA4C的表達(dá)從而影響RA-FLSs細(xì)胞增殖及侵襲。為探究miR-214-5p是否可通過調(diào)控SEMA4C的表達(dá)而發(fā)揮作用，本研究將miR-214-5p mimics與pcDNA-SEMA4C共轉(zhuǎn)染至RA-FLSs細(xì)胞中，SEMA4C的表達(dá)水平增高，RA-FLSs細(xì)胞增殖率和侵襲細(xì)胞數(shù)均增高，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水升高，說明高表達(dá)SEMA4C逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-214-5p對RA-FLSs細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，兩者在RA-FLSs細(xì)胞中存在調(diào)控關(guān)系。提示miR-214-5p可能通過調(diào)控SEMA4C表達(dá)從而影響RA-FLSs細(xì)胞增殖及侵襲。

綜上所述，在RA-FLSs細(xì)胞中，miR-214-5p下調(diào)，SEMA4C基因上調(diào)，miR-214-5p通過靶向SEMA4C調(diào)控RA-FLSs細(xì)胞增殖和侵襲。miR-214-5p有望成為RA診斷和治療新的靶標(biāo)。