miR-582-5p靶向DNMT1對人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響

高棟梁 高東東 白翠翠 楊波 楊喜明

瘢痕疙瘩是皮膚纖維增生性疾病，是皮膚科和外科最常見的問題之一。瘢痕疙瘩常伴有疼痛、瘙癢、畸形甚至嚴重的功能損害，對患者危害極大[1]。由于對其發病機制認識不足，瘢痕疙瘩的治療仍存在許多問題亟待解決。微小RNA(MicroRNA，miRNA/miR)是短的非編碼RNA，在許多重要的生物學過程中起關鍵作用，包括細胞增殖、分化和凋亡。有研究已經通過miRNA微陣列在瘢痕疙瘩和正常皮膚(組織或細胞)之間識別了差異表達的miRNA[2]。然而，miRNA在瘢痕疙瘩中的功能和具體作用尚未闡明。越來越多的證據表明，miR-582-5p是一種腫瘤抑制因子，與各種癌癥(子宮內膜癌、非小細胞肺癌、胃癌)的細胞增殖、凋亡和侵襲有關[3-5]。在哺乳動物細胞中，DNA甲基轉移酶1(DNA Methyltransferase 1，DNMT1)是最豐富的DNA甲基轉移酶[6]。DNMT1 mRNA和蛋白在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達較正常皮膚細胞升高，干擾其表達后細胞的增殖能力減弱，凋亡增強[7]。但miR-582-5p在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達及對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的影響，且miR-582-5p是否通過靶向調控DNMT1的表達影響瘢痕疙瘩成纖維的增殖和凋亡目前還尚未可知。因此，本研究觀察miR-582-5p在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達，以及其在瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡中的作用，并結合DNMT1，對其潛在的作用機制進行探討，為瘢痕疙瘩發病機制的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)購自美國Gibco公司，實時熒光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)相關檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司，異硫氰酸熒光素標記的膜聯素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin Ⅴ-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、DNMT1、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21蛋白、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia 2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋生物公司，miR-NC、miR-582-5p、si-NC、si-DNMT1、pcDNA、pcDNA-DNMT1購自上海吉瑪生物公司。

1.2 細胞分離培養 瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFB)和正常皮膚成纖維細胞(NFB)的分離培養參考楊力等[8]的方法操作。收集我院患者術后瘢痕疙瘩和正常皮膚標本，加入0.5%洗必泰浸泡5 min，之后用0.9%氯化鈉溶液充分漂洗，將標本剪成約1 mm3的碎片，加入20%胎牛血清的DMEM培養基培養。待細胞融合度達約80%時，進行接種傳代。

1.3 qPCR檢測miR-582-5p和DNMT1 mRNA表達 選取生長狀態良好的第4～8代瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFB)和正常皮膚成纖維細胞(NFB)，加入TRIzol試劑提取細胞中總RNA，通過逆轉錄試劑盒合成cDNA，按照試劑盒檢測說明書進行qPCR反應。miR-582-5p正向引物序列為5’-GCGGTTACAGTTGTTCAACC-3’，反向引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’，DNMT1正向引物序列為5’-CGACTACATCAAAGGCAGCAACCTG-3’，反向引物序列為5’-TGGAGTGGACTTGTGGGTGTTCTC-3’，內參GAPDH正向引物序列為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。根據計算2-ΔΔCt法計算miR-582-5p和DNMT1 mRNA表達。

1.4 Western Blot檢測DNMT1表達 KFB和NFB細胞中加入RIPA裂解液充分提取細胞總蛋白，蛋白經BCA法定量后，吸取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)電泳，電泳結束后轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2蛋白一抗(稀釋度為1∶1 000)，4℃孵育過夜，之后經Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(tris buffered saline with tween，TBST)漂洗8 min，重復3次，加入二抗(稀釋度為1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗8 min，重復3次，置化學發光液顯色，以GAPDH為參照，分析DNMT1蛋白表達量。

1.5 生物信息學預測與雙熒光素酶報告實驗 starBase網站預測miR-582-5p的靶基因，發現DNMT1的3’非編碼區(3’untranslated region，3’UTR)中含有與miR-582-5p互補的核苷酸序列。分別構建含有miR-582-5p結合位點的野生型DNMT1(WT-DNMT1)和突變型DNMT1(MUT-DNMT1)熒光素酶報告載體，按照Lipofectamine 2000試劑說明書，分別與miR-NC、miR-582-5p共轉染，轉染48 h，檢測雙熒光素酶活性。

1.6 細胞轉染 在6孔板中接種5×105個/ml的瘢痕疙瘩成纖維細胞，待細胞融合至70%時，依照Lipofectamine 2000試劑說明書的指示，將miR-NC、miR-582-5p、si-NC、si-DNMT1、pcDNA、pcDNA-DNMT1轉染到瘢痕疙瘩成纖維細胞，48 h后參照1.3和1.4所述方法分別檢測miR-582-5p、DNMT1、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達。

1.7 MTT檢測細胞增殖 將瘢痕疙瘩成纖維細胞密度調整為1×105個/ml，接種于96孔板，分別培養24 h、48 h、72 h后，加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h，加入150 μl二甲基亞砜，搖床震蕩反應10 min，置酶標儀檢測490 nm處的吸光度(OD)值。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集轉染后的瘢痕疙瘩成纖維細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書，將細胞密度調整為1×106個/ml，使用500 μl緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，輕搖混勻，加入5 μl PI染色液，輕搖混勻，避光孵育15 min，置流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2 結果

2.1 miR-582-5p和DNMT1在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達 qPCR和Western Blot檢測結果發現，與正常皮膚成纖維細胞NFB組比較，miR-582-5p在瘢痕疙瘩成纖維細胞KFB中表達量明顯減少，DNMT1 mRNA和DNMT1蛋白表達量顯著增加(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 DNMT1蛋白表達

表1 miR-582-5p和DNMT1在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達

2.2 miR-582-5p靶向調控DNMT1的表達 starBase預測結果顯示，miR-582-5p與DNMT1的3’UTR中部分堿基可形成互補配對。雙熒光素酶報告實驗結果表明，與miR-NC組比較，miR-582-5p明顯降低WT-DNMT1熒光素酶相對活性(P<0.05)，對MUT-DNMT1熒光素酶相對活性無顯著影響。Western Blot檢測結果發現，與miR-NC組比較，轉染miR-582-5p明顯減少DNMT1蛋白表達量，轉染anti-miR-582-5p較anti-miR-NC組顯著提高DNMT1蛋白水平(P<0.05)。見圖2，表2、3。

圖2 miR-582-5p靶向調控DNMT1的表達;A DNMT1的3’UTR中含有與miR-582-5p互補的核苷酸序列；B DNMT1蛋白表達

表2 雙熒光素酶報告實驗

表3 miR-582-5p調控DNMT1蛋白的表達

2.3 miR-582-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-582-5p過表達明顯增加瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-582-5p表達量，顯著降低細胞24 h、48 h、72 h的吸光度值，并明顯增加凋亡率，顯著降低CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白水平，明顯增加p21蛋白、Bax蛋白表達量(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 miR-582-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的影響;A 增殖、凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表4 miR-582-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的影響

2.4 抑制DNMT1表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的影響 與si-NC組比較，抑制DNMT1表達明顯減少瘢痕疙瘩成纖維細胞中DNMT1蛋白表達量、48 h、72 h的吸光度值(P<0.05)，對24 h的吸光度影響不明顯，以及顯著增加細胞凋亡率，明顯降低CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白水平，并顯著提高p21蛋白、Bax蛋白表達量(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 抑制DNMT1表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的影響;A DNMT1和增殖、凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表5 抑制DNMT1表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的影響

2.5 DNMT1過表達逆轉miR-582-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的作用 與miR-NC組比較，miR-582-5p過表達明顯減少瘢痕疙瘩成纖維細胞中DNMT1蛋白表達量、48 h、72 h的吸光度值、CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表達量(P<0.05)；對24 h吸光度值無明顯影響，顯著提高細胞凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白水平(P<0.05)。與miR-582-5p和pcDNA共轉染比較，miR-582-5p和pcDNA-DNMT1共轉染明顯提高DNMT1蛋白表達量、48 h、72 h吸光度值、CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表達量(P<0.05)，對24 h吸光度值無顯著影響，并且顯著降低細胞凋亡率、p21蛋白、Bax蛋白水平(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 DNMT1過表達逆轉了miR-582-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的作用；A DNMT1和增殖、凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表6 DNMT1過表達逆轉了miR-582-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的作用

3 討論

瘢痕疙瘩又稱瘢痕疙瘩病，是一種局部侵襲性的良性腫瘤，它超出了原來傷口的范圍，侵入周圍的健康皮膚[9]。這些瘢痕不僅影響美觀，而且造成疼痛和功能障礙，給患者帶來嚴重的生理和心理上的痛苦。瘢痕疙瘩屬于良性的真皮腫瘤，但瘢痕疙瘩的復發率高，術后畸形發生率高，單純手術切除難以治愈[10]。雖然最終導致瘢痕疙瘩形成的病理生理機制仍未完全闡明，但人們普遍認為瘢痕疙瘩是由成纖維細胞過度增殖和成纖維細胞凋亡不足導致的細胞動力學失衡的結果[11]。因此，研究與瘢痕疙瘩成纖維細胞有關的細胞和分子機制對改善瘢痕疙瘩的臨床治療意義重大。

迄今為止，在各種病變組織中發現了數百種miRNA的失調；然而，只有一小部分miRNA的生物學功能得到研究。已知miRNA可調節皮膚發育和基因表達的改變，并與皮膚病理相關，包括炎癥性疾病和惡性病變[12]。miRNA在皮膚纖維化中的主要功能是調節參與其發病機制和維持基因的表達[13]。然而，miRNA在瘢痕疙瘩發病機制中的功能作用仍不清楚。研究表明，miR-582-5p在子宮內膜癌組織中表達降低，過表達miR-582-5p抑制子宮內膜癌細胞增殖，促進細胞凋亡[3]。MiR-582-5p在涎腺腺樣囊性癌或非小細胞肺癌中低表達，上調其表達顯著抑制細胞的遷移、侵襲和增殖能力[14]。MiR-582-5p在胃癌組織中表達下調，過表達miR-582-5p抑制胃癌細胞的活性，促進細胞凋亡[5]。本研究中，qPCR檢測結果發現，與正常皮膚成纖維細胞NFB比較，瘢痕疙瘩成纖維細胞KFB中miR-582-5p表達明顯下調，miR-582-5p過表達明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表達，顯著促進細胞凋亡、p21蛋白、Bax蛋白表達。說明miR-582-5p在瘢痕疙瘩中同樣扮演著抑制因子的角色，其過表達可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖并誘導其凋亡。

已有證據表明，DNMT1參與宮頸癌[15,16]、非小細胞肺癌[17]等腫瘤的發生發展過程。與正常細胞相比，前列腺癌細胞中DNMT1 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，沉默其表達可明顯抑制前列腺癌細胞的增殖并促進細胞凋亡[18,19]。膀胱癌組織與膀胱癌細胞中存在DNMT1蛋白過表達的現象，抑制DNMT1表達能有效抑制腫瘤細胞的增殖和促進凋亡。本實驗中，瘢痕疙瘩成纖維細胞中的DNMT1 mRNA和DNMT1蛋白表達明顯上調，抑制DNMT1表達明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表達，顯著促進細胞凋亡、p21蛋白、Bax蛋白表達，與前述報道[18]一致，DNMT1的抑制會使瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖能力下降，細胞凋亡增加。并且，本研究發現，DNMT1是miR-582-5p的功能靶基因，上調或下調miR-582-5p表達明顯調控DNMT1的蛋白水平，進一步證實miR-582-5p可以靶向調控DNMT1。另外，DNMT1過表達逆轉了miR-582-5p過表達抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表達的作用，以及逆轉了miR-582-5p過表達促進細胞凋亡、p21蛋白、Bax蛋白表達的作用，這些結果表明，miR-582-5p過表達抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖并誘導細胞凋亡的作用可能是通過靶向調控DNMT1的表達來實現的。

綜上所述，miR-582-5p在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達下調，其過表達可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和誘導細胞的凋亡，作用機制與靶向調控DNMT1表達有關，為瘢痕疙瘩的臨床診治提供了新參考。