LncRNA MIR100HG靶向miR-142-5p誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的耐藥機(jī)制研究

何瑾瑜 于姣

肝癌是世界范圍的嚴(yán)重威脅生命健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈增長趨勢(shì)[1]。肝癌的治療主要采用手術(shù)、化療、放療等方法，但目前肝癌還不能根治，其中肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性是影響肝癌治療效果的重要原因[2]。索拉菲尼(Sorafenib，SFB)是一種雙芳基尿素類口服多激酶抑制劑，是臨床分子靶向治療肝癌的常用藥物。降低肝癌細(xì)胞耐藥性對(duì)于提高治療療效具有積極意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度超過200個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，其參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的耐藥性，影響腫瘤治療療效[3]。MIR100HG是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，研究顯示，MIR100HG在胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，其高表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。目前，筆者還未見MIR100HG參與影響肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)報(bào)道。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～25核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5]。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-204-5p可能是MIR100HG的靶基因。研究顯示，miR-204-5p在肝癌細(xì)胞中表降低，過表達(dá)miR-204-5p可抑制肝癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。本研究探討MIR100HG在肝癌細(xì)胞對(duì)SFB耐藥性中的作用及能否通過調(diào)控miR-204-5p表達(dá)影響肝癌細(xì)胞的耐藥性，以期為肝癌耐藥性的改善提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 Huh7細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)和RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，四甲基噻唑藍(lán)(methylthia-zoletrazolium，MTT)和胰蛋白酶(美國Sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)，miR-144-3p模擬物(mimics)及陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-142-5p抑制劑(anti-miR-142-5p)及陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、MIR100HG的小干擾RNA(si-MIR100HG)及陰性對(duì)照(si-NC)(上海吉?jiǎng)P基因公司)，Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)多克隆抗體(美國Abcam公司)，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(美國Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 Huh7細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇Huh7細(xì)胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換1次新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，加入適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細(xì)胞。吸棄PBS后，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 肝癌耐藥細(xì)胞株的建立:參照文獻(xiàn)方法建立肝癌耐索拉菲尼細(xì)胞株[7]。對(duì)數(shù)生長期的Huh7細(xì)胞，采用含0.1 μmol/L SFB的培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長狀況。若無細(xì)胞死亡，增加SFB的濃度，反復(fù)傳代培養(yǎng)，至Huh7細(xì)胞能夠在含1 μmol/L SFB的培養(yǎng)基中穩(wěn)定存活，即獲得Huh7耐索拉菲尼細(xì)胞株Huh7/SFB。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:對(duì)數(shù)生長期的Huh7/SFB細(xì)胞，調(diào)整濃度為2.5×104個(gè)/ml，每孔2.5 ml接種于6孔板中。細(xì)胞融合至60%時(shí)，更換無FBS的培養(yǎng)基。分別轉(zhuǎn)染si-MIR100HG、si-NC、pcDNA-MIR100HG、pcDNA、共轉(zhuǎn)染si-MIR100HG與anti-miR-142-5p、si-MIR100HG與anti-miR-NC至Huh7/SFB細(xì)胞。具體轉(zhuǎn)染過程參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明書。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞分組處理:Huh7、Huh7/SFB細(xì)胞分別用含2、4、8、16、32 μmol/L[7]SFB的培養(yǎng)基干預(yù)48 h。轉(zhuǎn)染si-MIR100HG、si-NC、共轉(zhuǎn)染si-MIR100HG與anti-miR-142-5p、si-MIR100HG與anti-miR-NC的Huh7/SFB細(xì)胞，均用含4 μmol/L SFB的培養(yǎng)基干預(yù)48 h，依次記為SFB+si-MIR100HG組、SFB+si-NC組、SFB+si-MIR100HG+anti-miR-142-5p組、SFB+si-MIR100HG+anti-miR-NC組。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中MIR100HG和miR-142-5p表達(dá)水平:Trizol試劑提取Huh7、Huh7/SFB細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA的純度和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μl。然后以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s(共進(jìn)行35個(gè)循環(huán))；72℃延伸30 s。引物序列：MIR100HG上游5’-GGCGACATCAGACAGAC AGA-3’，下游5’-AGGACCAGCTGAAAGGAACA-3’；miR-142-5p上游5’-TTGCGCTAGAGGA ATGCCG-3’，下游5’-GGACCACACCACTTGACA-3’；GAPDH上游5’-ACAACTTTGGTATC GTGGAAGG-3’，下游5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’；U6上游5’-CCTGCAAGCCCGACA CCTGG-3’，下游5’-GGTCCCGAATGCTAGCTCGCTT-3’。MIR100HG以GAPDH為內(nèi)參，miR-142-5p以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算MIR100HG和miR-142-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖:將培養(yǎng)后的Huh7、Huh7/SFB細(xì)胞或轉(zhuǎn)染后的Huh7/SFB細(xì)胞，調(diào)整濃度為2.5×104個(gè)/ml，每孔200 μl接種于96孔板中。按照1.2.4分組處理。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μl濃度為5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜，輕輕振蕩培養(yǎng)板，混合均勻后于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值(absorbance，A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率(%)=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組×100%。計(jì)算SFB對(duì)Huh7、Huh7/SFB細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:轉(zhuǎn)染后Huh7/SFB細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×104個(gè)/ml，每孔1 ml接種于24孔板中。按照1.2.4分組處理。培養(yǎng)結(jié)束后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。取1.0×106個(gè)細(xì)胞，加入適量PBS清洗細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，吸棄PBS。加入400 μl結(jié)合緩沖液，輕輕吹打，細(xì)胞混懸后，加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min。最后加入100 μl結(jié)合緩沖液，混勻后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 蛋白印跡(Western Blot)法檢測(cè)細(xì)胞中CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平:各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。RIPA蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白溶液，沸水浴中煮沸5 min。蛋白變性后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白上樣量為每泳道30 μg。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜后置于5 %脫脂牛奶中封閉1 h。分別加入CyclinD1(稀釋度1∶600)、p21(稀釋度1∶400)、Bcl-2(稀釋度1∶400)和Bax(稀釋度1∶400)抗體，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶200)，室溫孵育2 h。滴加ELC顯影液，避光顯影后凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MIR100HG與miR-142-5p靶向關(guān)系:生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，MIR100HG與miR-142-5p的核苷酸序列存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)。擴(kuò)增含miR-142-5p結(jié)合位點(diǎn)的MIR100HG的核苷酸序列，構(gòu)建MIR100HG野生型質(zhì)粒(WT-MIR100HG)。通過基因定點(diǎn)突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變后，構(gòu)建MIR100HG突變型質(zhì)粒(MUT-MIR100HG)。分別將miR-142-5p mimic、miR-NC與WT-MIR100HG、MUT-MIR100HG共轉(zhuǎn)染至Huh7/SFB細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，將所有細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。具體操作參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書嚴(yán)格按操作標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。各組的熒光素酶活性以熒光蟲活性/海腎熒光強(qiáng)度比值表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SFB對(duì)肝癌Huh7、Huh7/SFB細(xì)胞抑制率的影響 與Huh7細(xì)胞比較，不同濃度的SFB對(duì)Huh7/SFB細(xì)胞的抑制率降低(P<0.05)。SFB對(duì)Huh7/SFB細(xì)胞的IC50值約是Huh7細(xì)胞的15倍。見表1。

表1 不同濃度SFB對(duì)Huh7和Huh7/SFB細(xì)胞抑制率的影響

2.2 肝癌細(xì)胞和肝癌耐SFB細(xì)胞中MIR100HG和miR-142-5p表達(dá)水平 與Huh7細(xì)胞比較，Huh7/SFB細(xì)胞中 MIR100HG水平升高(P<0.05)，miR-142-5p水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 MIR100HG和miR-142-5p在Huh7和Huh7/SFB細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 MIR100HG靶向調(diào)控miR-142-5p的表達(dá) 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，與miR-142-5p可能是MIR100HG的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

顯示，與miR-NC組比較，miR-142-5p組共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-MIR100HG的熒光素酶活性降低(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染MUT-MIR100HG的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA-MIR100HG組miR-142-5p水平低于pcDNA組(P<0.05)，si-MIR100HG組miR-142-5p水平高于si-NC組(P<0.05)。說明MIR100HG靶向負(fù)調(diào)控miR-142-5p表達(dá)。見圖1，表3、4。

圖1 MIR100HG與miR-142-5p的核苷酸序列含有連續(xù)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表4 MIR100HG對(duì)miR-142-5p表達(dá)的影響

2.4 抑制MIR100HG表達(dá)聯(lián)合索拉菲尼對(duì)肝癌耐SFB細(xì)胞Huh7/SFB增殖和凋亡的影響 與SFB+si-NC組比較，SFB+si-MIR100HG組miR-142-5p水平、抑制率、凋亡率、p21和Bax蛋白水平升高(P<0.05)，MIR100HG水平、CyclinD1和Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 Western Blot檢測(cè)增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)Huh7/SFB細(xì)胞凋亡;A 增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表5 抑制MIR100HG表達(dá)聯(lián)合SFB對(duì)Huh7/SFB細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.5 抑制MIR100HG表達(dá)對(duì)肝癌耐SFB細(xì)胞Huh7/SFB增殖和凋亡的影響 與SFB+si-MIR100HG+anti-miR-NC組比較，SFB+si-MIR100HG+anti-miR-142-5p組miR-142-5p水平、抑制率、凋亡率、p21和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，CyclinD1和Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見圖3，表6。

圖3 Western Blot檢測(cè)增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)Huh7/SFB細(xì)胞凋亡;A 增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表6 干擾miR-142-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制MIR100HG表達(dá)對(duì)Huh7/SFB細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤，治療療效較差，主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物存在耐藥性。SFB是肝癌治療的常用藥物，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)SFB的敏感性可提高肝癌治療療效及改善患者預(yù)后。本研究通過使用含SFB的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌Huh7細(xì)胞，獲得了肝癌耐SFB細(xì)胞株Huh7/SFB，其中SFB對(duì)Huh7/SFB細(xì)胞的IC50值約是Huh7細(xì)胞的15倍。LncRNA可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等多個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生命過程，在腫瘤、心血管疾病等多種疾病中發(fā)揮重要作用[8]。LncRNA還參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的耐藥性。如劉正泰等[9]研究顯示，抑制LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)可增強(qiáng)卵巢癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞增殖。

MIR100HG是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Su等[10]研究顯示，MIR100HG在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，其高表達(dá)是骨肉瘤患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，抑制其表達(dá)可在體外抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前，MIR100HG對(duì)肝癌的影響還未知。本研究顯示，MIR100HG在耐SFB的肝癌細(xì)胞Huh7/SFB中呈高表達(dá)，與Lu等[11]報(bào)道的MIR100HG在耐西妥昔單抗的結(jié)直腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中表達(dá)升高結(jié)果一致，提示MIR100HG可能參與肝癌細(xì)胞對(duì)SFB的耐藥性。通過轉(zhuǎn)染MIR100HG的小干擾RNA至Huh7/SFB細(xì)胞中，結(jié)果顯示，抑制MIR100HG表達(dá)可提高SFB對(duì)Huh7/SFB細(xì)胞的抑制率，促進(jìn)SFB誘導(dǎo)的Huh7/SFB細(xì)胞凋亡及p21和Bax蛋白表達(dá)，抑制CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)，提示抑制MIR100HG表達(dá)通過降低SFB誘導(dǎo)的Huh7/SFB細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低Huh7/SFB細(xì)胞對(duì)SFB的耐藥性。

為探討MIR100HG影響Huh7/SFB細(xì)胞對(duì)SFB耐藥性的作用作用機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-142-5p可能是MIR100HG的靶基因。雙熒光素酶活性檢測(cè)及qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)MIR100HG在Huh7/SFB細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控miR-142-5p表達(dá)，這與MIR100HG在Huh7/SFB細(xì)胞中呈高表達(dá)，而miR-142-5p呈低表達(dá)的結(jié)果一致。研究顯示，miR-142-5p在骨肉瘤、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，過表達(dá)miR-142-5p可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]；過表達(dá)miR-142-5p可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[13]。本研究顯示，抑制miR-142-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制MIR100HG表達(dá)對(duì)SFB誘導(dǎo)的Huh7/SFB細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，說明抑制MIR100HG表達(dá)可能通過靶向上調(diào)miR-142-5p表達(dá)降低肝癌耐藥細(xì)胞Huh7/SFB對(duì)SFB的耐藥性。

綜上所述，肝癌耐SFB細(xì)胞中MIR100HG表達(dá)升高，抑制MIR100HG表達(dá)可降低肝癌耐SFB細(xì)胞對(duì)SFB的耐藥性，其可能通過靶向負(fù)調(diào)控miR-142-5p表達(dá)發(fā)揮作用，為改善肝癌對(duì)SFB的耐藥性并提高肝癌治療療效提供了新思路。