ADPGK-AS1調(diào)控miR-1301-3p基因表達(dá)影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究

周鑒基 王山 王太洪

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類生命健康。因此，探明胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制并尋找有效治療靶點(diǎn)對(duì)改善胃癌患者預(yù)后十分重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，Lnc RNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)是兩類小分子單鏈非編碼RNA，二者均參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等生命過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1，2]。研究表明，Lnc RNA與miRNA間存在相互作用，共同影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[3]。二磷酸腺苷依賴葡糖激酶反義RNA1(adenosine diphosphate dependent glucokinase antisense RNA 1，ADPGK-AS1)是一種新型的lncRNA。有報(bào)道，ADPGK-AS1在胃癌組織和細(xì)胞系中增加，其表達(dá)增加的胃癌患者預(yù)后較差，沉默ADPGK-AS1可抑制GC細(xì)胞增殖和遷移，可能為胃癌患者提供了新的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[4]。但目前，ADPGK-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡等惡性生物學(xué)行為影響的作用機(jī)制還未明確。DINAN生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，ADPGK-AS1與miR-1301-3p的核苷酸序列存在互補(bǔ)配對(duì)位點(diǎn)，miR-1301-3p可能是ADPGK-AS1的靶基因。miR-1301-3p是一種miRNA，參與結(jié)直腸癌[5]、乳頭狀甲狀腺癌[6]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前，miR-1301-3p在胃癌中的作用及ADPGK-AS1與miR-1301-3p在胃癌中的相互作用筆者還未見相關(guān)報(bào)道。本研究首先檢測胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27和Hs-746T中ADPGK-AS1和miR-1301-3p表達(dá)水平，并以HGC-27細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察沉默ADPGK-AS1、過表達(dá)miR-1301-3p及抑制miR-1301-3p對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人胃黏膜上皮正常細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS，HGC-27和Hs-746T(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、RPMI 1640培養(yǎng)基和LipofectamineTM2000試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazoletrazolium，MTT)(美國Sigma公司)，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)，PCR引物和兔抗剪切型聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(cleaved-poly adenosine diphosphate ribose polymerase，Cleaved PARP)多克隆抗體抗體(上海生工生物工程股份有限公司)，小鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體和兔抗人Ki-67單克隆抗體(廣州安必平醫(yī)藥科技公司)，兔抗剪切型半胱天冬酶-3(Cleaved caspases-3)、磷酸化p38(phosphorylated p38，p-p38)和磷酸化p53(phosphorylated p53，p-p53)多克隆抗體(北京中杉金橋生物試劑公司)，ADPGK-AS1小干擾RNA及亂序無意義陰性序列、miR-1301-3p 模擬物(mimcs)及陰性序列、miR-1301-3p 抑制劑及陰性對(duì)照、ADPGK-AS1過表達(dá)載體及空載體(美國Ambion公司)，熒光素酶報(bào)告載體(美國Promega公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑和雙熒光素酶活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人胃黏膜上皮正常細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27和Hs-746T均用含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%。每2～3天更換1次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，以1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細(xì)胞中ADPGK-AS1和miR-1301-3p表達(dá)：收集細(xì)胞，加入Trizol試劑，提取細(xì)胞中總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。引物序列：ADPGK-AS1上游5’-G GCTTGCCGGCCAAGTGCAGTAGT-3’，下游5’-CGTGACGCGCCAATGCGCGATGCT-3’；GAPDH上游5’-GGCCGCAAAGCTGGCGCGTGC-3’，下游5’-CGTGCGAACGCTGACGTGACG-3’；miR-1301-3p上游5’-GTGCGTGCAAACGCTGCGTG-3’，下游5’-GCAACGTAAGCTG CAGCTCG-3’；U6上游5’-CGTGCAACGTACGTCGTAGT-3’，下游5’-CGTAACCCGTGTCAC GTACC-3’。ADPGK-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-1301-3p以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-1301-3p和 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組：對(duì)數(shù)增殖期的HGC-27細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞融合至60%時(shí)，分別將ADPGK-AS1小干擾RNA(si-ADPGK-AS1組)、亂序無意義陰性序列(si-con組)、miR-1301-3p mimcs(miR-1301-3p組)、mimcs陰性對(duì)照(miR-con組)、與ADPGK-AS1過表達(dá)載體(pcDNA-ADPGK-AS1組)及空載體(pcDNA組)、ADPGK-AS1小干擾RNA與miR-1301-3p抑制劑(si-ADPGK-AS1+anti-miR-1301-3p組)、ADPGK-AS1小干擾RNA與miR-1301-3p抑制劑陰性對(duì)照(si-ADPGK-AS1+anti-miR-con組)轉(zhuǎn)染至HGC-27細(xì)胞。具體轉(zhuǎn)染過程參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(NC組)：HGC-27細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行任何操作。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞增殖：各組HGC-27細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μl的MTT(5 mg/ml)。培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜。振蕩溶解結(jié)晶紫后，混勻，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔吸光度值(absorbance，A)。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A空白對(duì)照組×100 %。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：各組HGC-27細(xì)胞，以每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，取1.0×106個(gè)細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合緩沖液，移液器輕輕吹打，混懸細(xì)胞。加入10 μl Annexin V-FITC，混勻，避光孵育10 min。加入5 μl PI，混勻，避光孵育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞凋亡率(%)=(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100 %。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，上清液即為提取細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度后，進(jìn)行定量。取適量蛋白溶液，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。然后以每孔30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，用轉(zhuǎn)膜儀將分離蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟膜，并置于5%脫脂奶粉中封閉2 h。洗膜后，分別置于PCNA、Ki-67、Cleaved PARP、Cleaved caspases-3、p-p38和p-p53抗體孵育液中，4℃孵育過夜。洗膜后，置于二抗孵育液中，37℃孵育1 h。洗膜后，滴加顯影液避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)：采用LipofectamineTM2000試劑盒將熒光素酶報(bào)告載體psiCHECK2-ADPGK-AS1-野生型(WT)和psiCHECK2-ADPGK-AS1-突變型(MUT)分別與miR-1301-3p mimic、mimic陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至HGC-27細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h 后，收集細(xì)胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞中ADPGK-AS1和miR-1301-3p表達(dá) 與GES-1細(xì)胞比較，胃癌細(xì)胞AGS、HGC-27和Hs-746T中ADPGK-AS1表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-1301-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)。由于胃癌細(xì)胞HGC-27中ADPGK-AS1和miR-1301-3p表達(dá)差異最顯著，因此選擇HGC-27細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 胃癌細(xì)胞中ADPGK-AS1和miR-1301-3p表達(dá)

2.2 沉默ADPGK-AS1抑制HGC-27細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡 與si-con組比較，si-ADPGK-AS1組ADPGK-AS1、HGC-27細(xì)胞存活率及PCNA、Ki-67和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和Cleaved PARP蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。NC組與si-con組各檢測指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 Western blot檢測HGC-27細(xì)胞PCNA、Ki-67、Cleaved PARP和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)和流式細(xì)胞術(shù)檢測HGC-27細(xì)胞凋亡

表2 沉默ADPGK-AS1對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 ADPGK-AS1 靶向調(diào)控miR-1301-3p表達(dá) DINAN生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，ADPGK-AS1與miR-1301-3p的核苷酸序列存在互補(bǔ)配對(duì)位點(diǎn)。與miR-con組比較，miR-1301-3p組共轉(zhuǎn)染ADPGK-AS1-WT 的細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染ADPGK-AS1-MUT的細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。si-ADPGK-AS1組miR-1301-3p水平高于si-con組(P<0.05)，pcDNA-ADPGK-AS1組miR-1301-3p水平低于pcDNA組(P<0.05)。見圖2，表3、4。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖2 ADPGK-AS1與miR-1301-3p核苷酸序列存在的互補(bǔ)配對(duì)位點(diǎn)

2.4 過表達(dá)miR-1301-3p抑制HGC-27細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞凋亡 與miR-con組比較，miR-1301-3p組HGC-27細(xì)胞存活率及PCNA、Ki-67和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，miR-1301-3p、細(xì)胞凋亡率和Cleaved PARP蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。NC組與miR-con組各檢測指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3，表5。

表4 ADPGK-AS1調(diào)控miR-1301-3p的表達(dá)

圖3 Western blot檢測HGC-27細(xì)胞PCNA、Ki-67、Cleaved PARP和Cleaved caspase-3的表達(dá)和流式細(xì)胞術(shù)檢測HGC-27細(xì)胞凋亡

表5 過表達(dá)miR-1301-3p對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5 抑制miR-1301-3p降低沉默ADPGK-AS1對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-ADPGK-AS1+anti-miR-con組比較，si-ADPGK-AS1+ anti-miR-1301-3p組HGC-27細(xì)胞存活率及PCNA、Ki-67和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-1301-3p、細(xì)胞凋亡率和Cleaved PARP蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表6。

表6 抑制miR-1301-3p降低沉默ADPGK-AS1對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6 ADPGK-AS1調(diào)控miR-1301-3p對(duì)HGC-27細(xì)胞p38MAPK信號(hào)途徑的影響 與si-con組比較，si-ADPGK-AS1組p-p38和p-p53蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與si-ADPGK-AS1+anti-miR-con組比較，si-ADPGK-AS1+ anti-miR-1301-3p組p-p38和p-p53蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。si-ADPGK-AS1組與si-ADPGK-AS1+anti-miR-con組p-p38和p-p53蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7，圖5。

表7 抑制miR-1301-3p對(duì)沉默ADPGK-AS1的HGC-27細(xì)胞p-p38和p-p53蛋白的影響

圖5 Western blot檢測HGC-27細(xì)胞p-p38和p-p53蛋白表達(dá)

3 討論

Lnc RNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。ADPGK-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種Lnc RNA，參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。Song等[7]研究顯示，ADPGK-AS1在胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，沉默ADPGK-AS1表達(dá)通過靶向上調(diào)miR-205-5p表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。Luo等[8]研究顯示，骨肉瘤組織和細(xì)胞中ADPGK-AS1表達(dá)升高，抑制ADPGK-AS1可通過靶向上調(diào)miR-542-3p表達(dá)降低骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，為骨肉瘤治療提供了新的治療靶點(diǎn)。

本研究顯示，胃癌細(xì)胞系中ADPGK-AS1表達(dá)升高，沉默ADPGK-AS1表達(dá)可抑制胃癌HGC-27細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞凋亡，與報(bào)道結(jié)果[4]一致，提示ADPGK-AS1是胃癌治療的潛在靶點(diǎn)，但其作用機(jī)制還有待探討。DNA損傷與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞受損后，DNA進(jìn)行修復(fù)，以恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)DNA修復(fù)過程受阻時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生改變，從而引起細(xì)胞死亡或腫瘤細(xì)胞異常增生[9]。PCNA是真核細(xì)胞DNA復(fù)制過程中的一個(gè)關(guān)鍵因子，參與DNA修復(fù)，其還可與多種蛋白因子結(jié)合參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等生命過程，與腫瘤的惡性程度正相關(guān)[10]。Ki-67是增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其表達(dá)越高，腫瘤細(xì)胞生長越快[11]。PARP參與細(xì)胞DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡。Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。caspases-3是caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，可放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。本研究顯示，沉默ADPGK-AS1表達(dá)后，HGC-27細(xì)胞中PCNA、Ki-67和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)降低，Cleaved PARP蛋白表達(dá)升高，提示沉默ADPGK-AS1表達(dá)可能通過抑制PCNA、Ki-67和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)并促進(jìn)Cleaved caspases-3蛋白表達(dá)來抑制HGC-27細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

為探討ADPGK-AS1影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，miR-1301-3p可能ADPGK-AS1的靶基因。研究顯示，miR-1301-3p在前列腺癌細(xì)胞和組織中呈高表達(dá)，其通過抑制GSK3β和SFRP1并激活Wnt途徑來促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞的擴(kuò)增，發(fā)揮致癌基因作用[12]。然而，miR-1301-3p在乳腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低，其靶向抑制ICT1表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞周期停滯和凋亡來抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗乳腺癌作用，可能是乳腺癌的治療靶點(diǎn)[13]。上述研究表明，miR-1301-3p在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同。目前，miR-1301-3p在胃癌中發(fā)揮的作用還未知。

本研究顯示，胃癌細(xì)胞系中miR-1301-3p表達(dá)降低，過表達(dá)miR-1301-3p可抑制胃癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示其作為抑癌基因參與胃癌發(fā)生發(fā)展。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-1301-3p mimics可降低ADPGK-AS1野生型細(xì)胞的熒光素酶活性，且上調(diào)細(xì)胞中ADPGK-AS1表達(dá)后，miR-1301-3p 表達(dá)降低，而下調(diào)ADPGK-AS1表達(dá)后，miR-1301-3p 表達(dá)升高，證實(shí)了ADPGK-AS1在胃癌HGC-27細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控miR-1301-3p表達(dá)。與胃癌細(xì)胞系中ADPGK-AS1表達(dá)降低，而miR-1301-3p表達(dá)升高一致。本研究還顯示，抑制miR-1301-3p表達(dá)降低了沉默ADPGK-AS1對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白PCNA、Ki-67、Cleaved PARP和Cleaved caspases-3表達(dá)的影響，提示沉默ADPGK-AS1通過靶向上調(diào)miR-1301-3p表達(dá)抑制HGC-27細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

p38MAPK信號(hào)通路是絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成員，參與細(xì)胞生長、分化和凋亡等過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。p38MAPK活化后，可使p53磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究顯示，p38MAPK信號(hào)通路的激活可抑制胃癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。本研究顯示，沉默ADPGK-AS1可促進(jìn)HGC-27細(xì)胞中p-p38和p-p53蛋白表達(dá)，提示沉默ADPGK-AS1可能通過激活p38MAPK信號(hào)通路抑制HGC-27細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究還顯示，抑制miR-1301-3p表達(dá)降低了沉默ADPGK-AS1對(duì)HGC-27細(xì)胞p-p38和p-p53蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，提示沉默ADPGK-AS1通過靶向上調(diào)miR-1301-3p表達(dá)進(jìn)而激活p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗胃癌作用，p38MAPK信號(hào)通路的激活可能是沉默ADPGK-AS1通過靶向上調(diào)miR-1301-3p表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。

綜上所述，ADPGK-AS1在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默其表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制可能與靶向上調(diào)miR-1301-3p表達(dá)進(jìn)而激活p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)。