USP15及α-SMA在青光眼濾過術后瘢痕組織中表達的實驗研究

全夫，劉艷，余玲

(1.西南醫科大學附屬醫院眼科，四川 瀘州 646000； 2.西南醫科大學，四川 瀘州 646000)

青光眼是一種病理性眼內壓升高導致特征性視神經損害和視野缺損的疾病，其發病率在全球范圍內呈持續升高趨勢[1]。目前，通過在球結膜下建立功能性濾過通道來控制眼壓的青光眼濾過手術(glaucoma filtration surgery，GFS)仍是治療青光眼的有效方法，但失敗率約為20%，導致手術失敗的主要原因是在手術區域內成纖維細胞的增殖致濾過通道的瘢痕形成，濾過通道功能減弱，從而導致眼壓再次升高[2-4]。

泛素特異性蛋白酶15(ubiquitin-specific proteases 15,USP15)的基因位于染色體帶12q14處，由952個氨基酸組成，分子量為109 200，屬于泛素特異性加工酶家族的一員[5-6]。研究表明，對小鼠進行USP15基因敲除，小鼠表現為切口愈合延遲，瘢痕化進展減慢[7]。在瘢痕纖維化過程中，USP15可維持轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)途徑的活性[8]，USP15可被介導與Smad泛素化因子2形成復合物，作用于TGF-β受體(transforming growth factor-β receptor，Tβ-R)并去泛素化Tβ-RⅠ，穩定Tβ-RⅠ，從而增強TGF-β信號通路轉導，促進纖維化過程[9]。王洋等[10]發現USP15與TGF-β信號通路作用相關，而TGF-β信號通路已被證明與瘢痕的形成密切相關。目前，USP15在瘢痕組織中表達的研究較少見。

從肉芽腫到瘢痕增生的形成過程中，肌成纖維細胞是組織瘢痕化的關鍵細胞，而肌成纖維細胞的主要組成成分為α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，即α-SMA表達水平越高，組織瘢痕化程度越嚴重[11-12]。本研究旨在通過檢測GFS術后瘢痕組織中USP15和α-SMA的表達并分析兩者的關系，為研究如何抑制GFS術后濾過通道的瘢痕化提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物 20只健康成年新西蘭大白兔，清潔級別，不分雌雄，體重1.65～1.75 kg，由西南醫科大學動物實驗中心提供[使用許可證：SYXK(川)2018-065]，室溫約26 ℃，實驗前將凈水和人工飼料混合并飼養1周。實驗遵守視覺與眼科學研究協會有關動物在眼科及視力方面研究的規定。

1.2主要儀器及試劑 光學顯微鏡(日本Olympus公司)；眼科顯微手術器械(中國蘇州醫療器械有限公司)；Tono-pen眼壓計(美國Reichert公司)；USP15抗體(英國Abcam公司)；α-SMA抗體(英國Abcam公司)；免疫組織化學試劑盒(江蘇江萊生物科技有限公司)。

1.3方法 采用自身雙眼對照設計研究，以右眼為實驗組(20只)，建立GFS的動物模型，左眼作為正常對照組(10只)。隨機將實驗組分為術后14 d組(10只)、術后28 d組(10只)。對家兔行苯巴比妥鈉1 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，術前局部用鹽酸丙卡因滴眼液表面麻醉。右眼常規消毒、鋪巾，沿角膜緣用鈍頭的Westcott剪刀切開并直接切開結膜和腱膜。用30°彎刀制造3 mm×4 mm的鞏膜瓣(1/2鞏膜厚度)，無齒鑷提起半厚的鞏膜瓣，直到觀察到小梁，眼科剪剪除Schlemm管和小梁網在內的矩形角鞏膜以及部分外周虹膜根部，放下鞏膜瓣將鞏膜瓣兩端各縫1針，球結膜用10-0尼龍針縫合2針。術后使用左氧氟沙星滴眼液預防感染。同一人使用Tono-pen眼壓計于同一日上午9：00～11：00測量家兔眼壓，同眼連續測量3次，取平均值。術前測量實驗組和正常對照組眼壓，術后測量14 d組和28 d組眼壓。實驗組分別在術后14 d和28 d觀察角膜、前房、濾過泡及瘢痕組織的外觀，并在術后14 d及術后28 d瘢痕組織上分別進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)、Masson和免疫組織化學染色，分析實驗組瘢痕組織和正常對照組結膜組織中USP15和α-SMA的表達。

1.4結果判定標準 采用Sinicrope等[13]的標準對每個視野的陽性細胞數和染色深度進行評分，總分為染色強度得分和陽性染色細胞百分比得分的乘積。染色強度確定標準：無色或淺黃色與背景一致為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。其中0分表示陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強陽性。陽性染色細胞的百分比標準：每個標本隨機選擇3個視野，每個視野計數100個細胞，并計算3個視野中陽性細胞的平均數量，其中<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。

2 結 果

2.1造模結果

2.1.1眼壓結果 實驗組基線眼壓為(15.00±0.67) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，正常對照組為(14.90±0.74) mmHg，兩組比較差異無統計學意義(t=0.857，P=0.379)。正常對照組、術后14 d組、術后28 d組眼壓比較差異有統計學意義(P<0.01)，術后14 d組眼壓低于正常對照組(P<0.05)，術后28 d組與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，術后28 d組高于術后14 d組(P<0.05)，見表1。

表1 正常對照組與實驗組眼壓比較

2.1.2HE染色結果 正常結膜組織HE染色示結膜組織形態完整，組織排列較整齊；術后14 d結膜組織HE染色示結膜下炎癥細胞浸潤、纖維組織形成，組織排列紊亂，濾過道受到牽拉、變窄；術后28 d結膜組織HE染色示結膜下大量纖維組織收縮，濾過道消失。見圖1。

1a：正常結膜組織；1b：術后14 d結膜組織；1c：術后28 d結膜組織；箭頭表示該處染色的變化

2.1.3Masson染色結果 正常結膜組織Masson染色示結膜下組織極少量膠原沉積；術后14 d結膜組織Masson染色示結膜下及濾過道少量膠原沉積；術后28 d結膜組織Masson染色示結膜下及濾過道大量膠原沉積。見圖2。

2a：正常結膜組織；2b：術后14 d結膜組織；2c：術后28 d結膜組織；箭頭表示該處染色的變化

2.2瘢痕組織USP15及α-SMA的表達水平

2.2.1USP15的表達 正常結膜組織中，USP15為陰性或弱陽性表達，極少量表達于結膜上皮層和基質層胞質及胞核；術后14 d瘢痕組織中，USP15少量表達于結膜上皮層及基質層成纖維細胞質及胞核；術后28 d瘢痕組織中，USP15大量表達于結膜上皮全層及成纖維細胞質及胞核，見圖3。各組USP15表達比較差異有統計學意義(P<0.01)，術后14 d組、術后28 d組高于正常對照組，術后28 d組高于術后14 d組(P<0.05)，見表2。

表2 正常對照組與實驗組瘢痕組織中USP15表達水平的比較

3a：正常結膜組織中USP15弱陽性表達；3b：術后14 d結膜瘢痕組織中USP15陽性表達；3c：術后28 d結膜瘢痕組織中USP15強陽性表達；箭頭表示該處USP15陽性表達

2.2.2α-SMA的表達 各組α-SMA表達比較差異有統計學意義(P<0.01)，術后14 d組、術后28 d組高于正常對照組，術后28 d組高于術后14 d組(P<0.05)，見表3。正常結膜組織中，α-SMA為陰性或弱陽性表達，極少量表達于結膜上皮層和基質層胞質及胞核；術后14 d結膜組織中，α-SMA少量表達于結膜上皮層及基質層成纖維細胞質及胞核；術后28 d結膜組織中，α-SMA大量表達于結膜上皮全層及成纖維細胞質及胞核，見圖4。

表3 正常對照組與實驗組瘢痕組織α-SMA表達水平比較

4a：正常結膜組織中α-SMA弱陽性表達；4b：術后14 d結膜瘢痕組織中α-SMA陽性表達；4c：術后28 d結膜瘢痕組織中α-SMA強陽性表達；箭頭表示該處α-SMA陽性表達

2.3瘢痕組織中USP15與α-SMA表達的相關性 Pearson相關分析結果顯示，正常結膜組織中USP15與α-SMA表達無相關性(r=0.063，P=0.297)；術后14 d瘢痕組織中USP15與α-SMA表達呈正相關(r=0.865，P<0.001)；術后28 d瘢痕組織中USP15與α-SMA表達呈正相關(r=0.976，P<0.001)。

3 討 論

青光眼是一種致盲性眼病，可對視神經及視野造成不可逆的損害。GFS已成為青光眼治療的標準手術方法，但術后濾過道的瘢痕形成是手術失敗的最常見原因[14]。目前關于GFS術后瘢痕形成機制的研究較多。USP15廣泛分布于人體的各個組織器官，其作為去泛素化酶的成員，可參與細胞內蛋白質的去除過程，同時在調節DNA轉錄與修復、細胞生長與凋亡、免疫應答中起關鍵作用。有研究表明，TGF-β信號通路可通過調節磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號而上調USP15信號，從而穩定p53并抑制腫瘤惡化[15-16]。故腫瘤等疾病的發生發展可能是由于USP15的高表達引起TGF-β信號轉導過程失調所致。以上研究結果顯示，USP15與TGF-β信號通路可能具有相互調節的作用。

在增生性瘢痕形成過程中，TGF-β信號通路主要通過TGF-β/Smad發揮生物學調控作用，而Tβ-R又是TGF-β/Smad信號轉導通路的關鍵受體，其異常表達與瘢痕的形成密切相關。TGF-β通過膜受體Tβ-RⅠ和Tβ-RⅡ活化前體物質后與Tβ-RⅡ結合形成Tβ-RⅡ復合物，并迅速引起Tβ-RⅠ磷酸化，激活靶基因的轉錄[17]。Smad7蛋白可通過與Smad3競爭Tβ-RⅠ而阻止受體介導的Smad3活化，阻斷TGF-β信號轉導，從而負反饋調節TGF-β/Smad信號通路[18]。研究顯示，Smad7還可介導USP15去泛素化并穩定Tβ-RⅠ增強TGF-β信號通路轉導過程，該過程由Smad7介導USP15與Smad泛素化調節因子2形成復合體，使USP15作用于Tβ-RⅠ并使其去泛素化，從而在穩定Tβ-RⅠ的同時增強TGF-β信號轉導[9，19]。也有研究發現，USP15可被腫瘤壞死因子受體相關因子4通過拮抗Smad泛素化調節因子2促進其與Tβ-R作用，使Tβ-RⅠ去泛素化并穩定，從而增強 TGF-β信號轉導[20]。

本研究對家兔進行術前、術后眼壓測量，結果顯示術后14 d、28 d眼壓逐漸升高，組織瘢痕增生逐漸增加，與既往研究結果一致[21]，說明兔眼GFS術后模型成功建立。同時，本研究結果還顯示，USP15在GFS術后14 d、28 d結膜瘢痕組織中異常高表達，并且與α-SMA表達呈正相關，驗證了USP15在瘢痕組織中的高表達同樣可能使TGF-β信號轉導過程失調，促進組織瘢痕增生[15-16]。而USP15是否協同Smad7及其他相關因子調節TGF-β信號通路在瘢痕組織形成過程中的作用可能是下一步研究USP15調控TGF-β信號通路具體機制的方向。

綜上所述，USP15在瘢痕組織中異常高表達，且與α-SMA相關，提示USP15可能在GFS術后的濾過道瘢痕形成過程中發揮作用，可為GFS術后瘢痕的發病機制和治療提供新的研究目標和思路。