內生真菌發酵對刺五加異嗪皮啶合成的影響

萬 璐，閆佳佳，鄭春英

（1黑龍江大學/農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

刺五加(Acanthopanaxsenticosus)為五加科植物刺五加的干燥根和根莖或莖[1]，主要分布于中國東北部，為藥食同源功能性保健食品[2]。現代研究表明，刺五加具有抗腫瘤[3]、抗疲勞[4]、抗炎[5]、降壓[6]、抗心肌缺血[7]、免疫調節[8]等作用，其主要的活性成分為刺五加苷[9]、黃酮類成分[10]、多糖[11]、香豆素[12]等，其中刺五加香豆素成分的代表為異嗪皮啶，該成分是刺五加的重要指標性成分[13]，其結構見圖1。

圖1 異嗪皮啶化學結構

異嗪皮啶具有抗炎[14]、抗氧化[15]、抗腫瘤[16]、冠脈保護[17]及神經保護[18]等生物活性，并具有無毒、口服易吸收的特點[19]，其具有多靶點作用已成為研究熱點。異嗪皮啶通常由天然植物中分離得到，尤其是從刺五加植物中分離得到[20]，并作為主要的活性成分指標來評價其質量及代謝機制。隨著異嗪皮啶應用的廣泛，有學者采用化學合成的方法制備異嗪皮啶[21]，但化學合成方法往往步驟較多，中間產物控制條件較嚴格，因而增加了合成的成本和難度。

發酵技術利用微生物的強大酶系，定向生物轉化天然食品中的某些活性成分，并通過這樣的生物轉化保護某些活性成分，提高活性成分的得率[22]，是功能性保健食品活性成分獲得的新方法。本研究在前期工作的基礎上[23]，利用植物內生菌參與宿主植物活性成分生物轉化的機制，使其誘導宿主植物活性代謝產物產生[24]，選取刺五加內生真菌發酵刺五加，以定向高效產生刺五加中異嗪皮啶成分；同時采用柱色譜法對發酵刺五加中異嗪皮啶成分進行分離，確定工藝路線，旨在提高異嗪皮啶的得率并最大限度提高刺五加資源利用率，為定向生產異嗪皮啶提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3年生野生健康刺五加樣品，采自黑龍江省帽兒山地區，存于黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業實驗室。刺五加內生真菌AJ7、AJ14、AJ15、AJ19由黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業實驗室分離得到。

PDA培養基（配方及配制方法參閱文獻[25]）。供含量測定用異嗪皮啶（中國藥品生物制品檢定院）。

1.2 主要儀器

FL2200型高效液相色譜儀（浙江溫嶺福立分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 發酵樣品的制備 分別取已活化的4株刺五加內生真菌，參閱文獻[26]制備菌懸液(1×107CFU/mL)；精確稱取刺五加根、莖粉末（陰干，粉碎，40目篩）各6 g，分別置于三角瓶中，加水（料液比1:5）密封，作為底物，滅菌（121℃，滅菌30 min）；分別取上述4種菌懸液各5 mL加入底物中(n=10)，搖床發酵培養（28℃，140 r/min，15天），取出凍干，作為發酵樣品，備用；另取無菌水5 mL加入底物中，同法培養作為空白對照樣品。

1.3.2 發酵前后刺五加異嗪皮啶成分的動態變化 參閱文獻[27]確定HPLC分析條件為：Venusil XBP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，USA)，流動相為乙腈:0.1%磷酸(20:80)，流速1 mL/min，檢測波長343 nm，進樣量10 μL。

（1）對照品溶液的制備。精密稱取異嗪皮啶對照品，加入適量甲醇溶劑，制成1.0 mg/mL對照品溶液，備用。

（2）供試品溶液的制備。精密稱取1.3.1發酵樣品1.0 g，加入10 mL甲醇溶劑，超聲1 h，取出，放冷，甲醇補足減失的溶劑，過濾（0.45 μm微孔濾膜），即為供試品溶液，備用。

（3）HPLC測定。分別精密吸取上述對照品溶液及供試品液，進樣，測定(n=3)，計算含量，觀察異嗪皮啶含量的動態變化，并根據HPLC測定結果確定發酵菌株。

1.3.3 發酵刺五加中異嗪皮啶的分離 根據1.3.2分析結果確定發酵菌株，按1.3.1方法制備刺五加發酵樣品，取發酵樣品200 g，加入95%乙醇1600 mL，熱回流提取180 min，過濾，濾液濃縮至100 mL，以氯仿萃取3次，每次100 mL，合并萃取液，回收溶劑并濃縮至清膏（相對密度約1.10），采用硅膠拌樣均勻后，將其通過硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(1:1)洗脫，分離工藝流程見圖2。

圖2 發酵刺五加中異嗪皮啶成分的分離工藝流程

1.3.4 發酵菌株的鑒定 參閱文獻[28]，采用形態學觀察及ITS rDNA序列擴增及序列分析法對發酵目的菌株進行種屬鑒定（通用引物IS1、IS4及PCR產物測序均委托上海生工生物工程股份有限公司）。將所得序列提交GenBank數據庫，采用Blast分析與GenBank中序列進行比較，構建系統發育樹（MEGA 6.0軟件），確定親緣關系和系統進化分析。

2 結果與分析

2.1 發酵前后刺五加中異嗪皮啶成分的動態變化結果

由圖3可以看出，刺五加樣品在與刺五加生藥及異嗪皮啶對照品相同的保留時間內有相同的色譜峰，該色譜峰明顯增高。

圖3 內生真菌AJ14發酵刺五加后的HPLC色譜圖

由表1、圖4可以看出，4株刺五加內生真菌(AJ7、AJ14、AJ15、AJ19)均能使發酵刺五加樣品中異嗪皮啶活性成分含量提高，但提高程度有差別，其中以內生真菌AJ14提高發酵樣品中異嗪皮啶含量作用最為顯著。與刺五加生藥相比，AJ14發酵刺五加莖和根樣品中異嗪皮啶成分的含量得到顯著增長，其增長率分別為刺五加莖及根的2.62、1.52倍，而且均高于其他3株內生菌發酵樣品中異嗪皮啶成分的增長幅度(P＜0.01)。因此選取菌株AJ14作為發酵目的菌株，以最大化提高發酵樣品中異嗪皮啶成分含量。

表1 刺五加發酵樣品中異嗪皮啶含量測定結果 mg/g

圖4 刺五加莖發酵樣品異嗪皮啶含量測定結果

2.2 發酵刺五加中異嗪皮啶成分的分離結果

采用對照品跟蹤法對AJ14發酵刺五加樣品中異嗪皮啶成分進行分離，其中在洗脫劑為石油醚:乙酸乙酯(1:1)的餾分中得到單一斑點，且與異嗪皮啶對照品Rf值相近，結果見圖5。回收該餾分溶劑，經乙醇重結晶，得淡黃色結晶（115.45 mg，得率為0.58 mg/g）；同法從生藥刺五加中提取分離異嗪皮啶，結果得到淡黃色結晶（13.87 mg，得率為0.07 mg/g）。分別采用3種色譜條件（①乙腈:0.1%磷酸(1:4)；②乙腈:甲醇:水:冰醋酸(17:3:80:1)；③甲醇:0.05%三氟乙酸(25:75)）對所得結晶采用HPLC進行純度分析，結果表明，該結晶純度較好，其中色譜①的分析結果見圖6。

圖5 TLC檢測結果

圖6 分離得到的異嗪皮啶結晶HPLC色譜圖

由圖6可知，從刺五加發酵樣品中分離得到的結晶純度較高，經計算其純度為99.10%，并且該結晶與對照品異嗪皮啶具有相同的保留時間，最后采用對照品加入法確定該成分為異嗪皮啶。

上述結果說明，使用刺五加內生真菌發酵刺五加可以明顯提高異嗪皮啶含量，使刺五加原料得到最大限度的利用；同時，采用一次硅膠柱色譜分離法可以分離發酵刺五加樣品中異嗪皮啶成分，工藝流程操作簡單、易行，適合異嗪皮啶成分原料的生產。

2.3 刺五加內生真菌AJ14鑒定結果

刺五加內生真菌AJ14經28℃、7天PDA培養后，菌落生長較快，菌絲體顯白色，分生孢子面為赭黃色，質地絲絨狀，分生孢子頭球形，頂囊球形，直徑35 μm，表面全部可育，產孢結構雙層（圖7）。參閱《真菌鑒定手冊》[29]，初步認定內生真菌AJ14菌株為赭曲霉屬菌。

圖7 AJ14菌落形態及孢子顯微結構

內生真菌AJ14經PCR擴增獲得1條567 bp的特異性條帶，將該測序結果在GenBank中進行BLAST同源性比對，構建系統發育樹（MEGA6.0軟件），結果見圖8。內生真菌AJ14菌株（菌種登錄號MT826636）的ITS rDNA序列與赭曲霉屬菌(AspergillusochraceusKJ783266.1)的同源性達到了98%以上，結合形態學觀察結果，將內生真菌AJ14菌株鑒定為赭曲霉菌(Aspergillusochraceus)。

圖8 內生真菌AJ14菌株的系統發育樹

3 結論與討論

盡管發酵技術用于食品的生產有著悠久的歷史[30]，但采用發酵技術定向提高天然食品中的活性成分的研究鮮有報道。本研究是在課題組前期研究基礎上[31]，基于異嗪皮啶的生物合成，結合內生真菌能夠參與宿主植物活性代謝物生物合成的研究基礎，采用4株刺五加內生真菌發酵宿主植物刺五加，旨在高效生產異嗪皮啶，并對其采用柱色譜法進行分離，以最大限度利用刺五加資源；同時，為深入研究內生真菌發酵刺五加的機理，也對所篩選目的菌株AJ14進行菌種鑒定。研究結果表明，采用刺五加內生真菌AJ14發酵刺五加后，其異嗪皮啶成分含量得到顯著提高；同時，針對異嗪皮啶成分，采用一次柱色譜分離法從發酵刺五加樣品中分離得到異嗪皮啶；目的菌株AJ14經鑒定為為赭曲霉菌(Aspergillusochraceus)。

本研究表明，內生真菌發酵法可定向促進刺五加中異嗪皮啶的生物合成；同時，采用一次柱色譜法分離發酵樣品中異嗪皮啶的工藝簡單易行，適合異嗪皮啶原料的工業化生產。同時，在研究過程中發現，內生真菌發酵刺五加時也有其他未知化合物的生成，為了闡明內生真菌發酵刺五加的機理，后續課題組將對發酵刺五加中的代謝產物進行系統分離，以發現新型活性代謝產物，為創制新藥、研發新型功能性保健食品奠定基礎。