低共熔溶劑提取黃芩苷及其復合保鮮液在鮮肉中的應用

魏夏夏，張曉虎，鄭 妍

（商洛學院生物醫藥與食品工程學院/陜西秦嶺特色生物資源產業技術研究院，陜西商洛 726000）

0 引言

隨著社會經濟的高速發展，人們對食品質量安全要求越來越高，從開始追求“民以食為天”發展到“食以安為先”。食品添加劑被譽為“食品工業的靈魂”，在現代食品加工過程中功不可沒。天然食品防腐保鮮劑對人體無毒害作用，可以有效地防止微生物污染，避免食物腐敗變質，從而減少食物的浪費，開發天然食品保鮮劑已成為食品科學領域研究的熱點之一[1-3]。商洛因藥用植物資源豐富而被譽為“秦嶺藥庫”，但當地企業卻未能將所收獲的藥材進行全面深加工，現有相關產品較為單一，且對其利用率普遍較低。張曉虎等[4]采用超聲輔助乙醇提取商洛黃芩中漢黃芩素，在最優提取條件下漢黃芩素提取率為0.526%。

研究表明，黃芩富含多種對人體健康有益的活性成分，具有抗炎[5]、抗病毒[6-8]、抗癌[9]等作用。其主要活性成分黃芩苷具有一定的生物活性，能夠抑制各種導致食品腐敗的微生物。劉昊等[10]研究表明7 mg/mL的黃芩苷能夠增加大腸桿菌細胞膜的通透性，使內容物溢出導致細胞失活，從而達到抑制大腸桿菌的作用。目前，黃芩苷的提取主要包括水提法[11]、微波法[12]、超聲法[13]、CO2-超臨界流體萃取法[14]，對比發現微波提取是一種高效、綠色、提取率高的提取方法。目前采用DESs作為溶劑提取天然活性成分已經受到越來越多國內外學者的關注[15-17]。

鑒于以上敘述，本研究采用微波輔助低共熔溶劑提取黃芩中的有效抑菌成分黃芩苷，復配殼聚糖、檸檬酸制成復合保鮮液并應用于鮮肉保鮮。基于DESs作為提取溶劑的優點與微波技術的優勢，以DESs作為提取溶劑輔助微波提取黃芩苷，旨在提高黃芩中黃芩苷的提取率，從而實現商洛黃芩的充分利用；采用響應面法優化單因素實驗所得的3因素3水平結果，通過分析得到黃芩苷提取的優化工藝參數，以期為黃芩苷的提取工藝提供參考依據。將黃芩苷復合保鮮液應用于鮮肉保鮮，通過測定鮮肉的理化指標評價復配保鮮劑對鮮肉品質的影響，為肉類貯藏保鮮的實際應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 黃芩于2019年9月采挖于商洛市商州區黃芩基地；鮮肉購于商洛市商州區華潤萬家超市。

1.1.2 試劑 黃芩苷標準品（批號110715-201318，上海純優生物科技有限公司，純度＞98%）；四丁基氯化銨、四辛基溴化銨、甲基三辛基氯化銨、甲基三辛基溴化銨、癸酸；檸檬酸、殼聚糖；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（商洛學院微生物實驗室提供）。

1.2 實驗儀器

研究所用儀器列于表1。

表1 實驗儀器

1.3 實驗方法

1.3.1 材料預處理 黃芩根清洗后于室溫風干，40℃烘箱烘干，粉碎，過40目篩，備用。

1.3.2 DESs的合成與制備

（1）DESs的合成。稱取摩爾比分別為2:1、1:1、1:2的癸酸（DecA，作供氫體）與四丁基氯化銨(N4444-Cl)、四辛基溴化銨(N8888-Br)、甲基三辛基氯化銨(N8881-Cl)和甲基三辛基溴化銨(N8881-Br)（作受氫體）于圓底燒瓶中，加熱至澄清，過夜后得不同性質的DESs。所合成的低共熔溶劑見表2。

表2 不同組分的低共熔溶劑

（2）標準曲線的繪制。精確稱定黃芩苷標準品50 mg于100 mL量瓶，乙醇定容至刻度線，得0.5 mg/mL的黃芩苷標準液。分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的標準液于100 mL容量瓶中，乙醇定至刻度線，搖勻，在278 nm處測吸光度，以黃芩苷濃度作橫坐標，吸光度作縱坐標，繪制標準曲線并得出回歸方程，見圖1。

圖1 黃芩苷標準曲線

（3）微波輔助提取黃芩苷的溶劑篩選。稱取0.5 g黃芩粉末于燒杯中，加入10 mLDESs溶劑，參考文獻[18]實驗條件，得黃芩苷粗提液，過濾后吸取1.0 mL于100 mL容量瓶中，乙醇定容，測吸光度，分別計算不同DESs提取黃芩苷的得率。

1.3.3 單因素實驗 以黃芩苷的提取率為指標，考察微波功率(500、600、700、800、900 W)、反應時間(5、10、15、20、25 min)、反應溫度(60、70、80、90、100℃)、液固比[10:1、15:1、20:1、25:1、30:1(mL:g)]對黃芩苷提取率的影響，以確定響應面優化的實驗因素及相應水平。

1.3.4 響應面優化實驗 依據1.3.3單因素優化結果，選用最佳DESs作為提取溶劑，以黃芩苷提取率為響應值，采用Box-Behnken設計三因素三水平的響應面優化實驗。

1.3.5 抑菌實驗 參考文獻方法制備培養基[19]。挑取菌種于無菌水中，震蕩，制成菌懸液。向各滅菌后的培養基注入融化后的培養基，將菌懸液倒入混合，冷卻待用。將濾紙分別在不同濃度的黃芩苷溶液浸漬后，取出后放置于培養基。在37℃溫度條件下培養48 h后測量無菌圈的直徑。

1.3.6 復合保鮮液的配制 取不同濃度的黃芩苷與1.5%殼聚糖、1%檸檬酸進行復配，將研制的復合保鮮液用于鮮肉的防腐保鮮實驗，通過測定有關理化指標，檢驗其保鮮效果。

取鮮肉，均勻分為5組，用無菌水清洗后分別進行5個實驗處理。處理1，對照組1(CT)空白對照組；處理2，對照組2(VC-Na)0.05%抗壞血酸鈉；處理3，含0.1%黃芩苷的復合保鮮液；處理4，含0.2%黃芩苷的復合保鮮液；處理5，含0.3%黃芩苷的復合保鮮液。分別在制備的不同濃度的防腐保鮮液中浸泡5 min，分別置于無菌托盤上用保鮮膜密封，在40℃、相對濕度70%的恒溫培養箱中進行保藏實驗。

1.3.7 測定指標 pH測定參考GB 5009.237—2016的方法；參考GB/T 5009.228—2016根據消耗鹽酸的量計算揮發性鹽基氮的含量；過氧化值的測定參考GB 5009.227—2016中的滴定法，計算如式(1)。

式中，V1為試樣用去的Na2S2O3溶液體積，mL；V0為空白試樣用去的Na2S2O3溶液體積，mL；c為Na2S2O3溶液的濃度，mol/L；m為試樣的質量，g。

2 結果與分析

2.1 不同DESs對黃芩苷提取率的影響

在其他實驗條件相同的條件下，比較合成的不同性質的DESs對黃芩苷提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 不同低共熔溶劑的提取效果

結果表明，DES-1對黃芩苷提取率最高，為最優提取溶劑，因此本實驗最終選取DES-1為提取溶劑。推測是DESs-1能夠與黃芩苷分子之間形成較強的氫鍵，黃芩苷能夠更好地溶解在溶劑中，最終的提取率達到最高。

2.2 單因素實驗結果分析

單因素實驗分別考察了提取時間、提取溫度、微波功率、液固比對黃芩苷提取率的影響，結果如圖3所示。根據單因素實驗結果，最終選取微波功率700 W，提取時間10、15、20 min，提取溫度70、80、90℃，液固比15:1、20:1、25:1(mL:g)為各因素水平。

圖3 單因素實驗結果

2.3 響應面優化實驗

2.3.1 響應面實驗方案與結果 實驗具體處理情況及結果如表3。

表3 響應面實驗方案與結果

2.3.2 回歸分析 黃芩苷提取率響應面二次模型方差分析見表4，方差分析見表5。

表4 黃芩苷提取率響應面二次模型方差分析表

表5 方差分析表

對實驗數據進行多元回歸擬合，得到黃芩苷提取率的回歸方程，如式(2)。

式中，Y為提取率，mg/g；A為提取溫度，℃；B為提取時間，min；C為液固比。

根據回歸方程可知，各因素影響黃芩苷提取率由大到小表現為提取時間＞液固比＞提取溫度。

由方差分析表可知模型P＜0.0001，該模型差異極顯著，可以用來預測工藝參數。自變量一次項提取時間B、液固比C，交互項AB、AC，二次項A2、B2、C2均差異極顯著；失擬項P=0.1073＞0.05，無失擬因素存在，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。復合相關系數R2為0.9895，變異系數為1.11%，均說明模型擬合優度較好。

2.3.3 響應面分析 圖4反映了各因素影響黃芩苷提取率的交互作用。從圖中可以看出，在提取溫度一定時，黃芩苷提取率隨著提取溫度的升高，在13～18 min時達到最大，當提取時間一定時，隨著提取時間的延長，在提取溫度達到74～90℃時黃芩苷提取率達到最大；當提取時間一定時，隨著液固比的增大，黃芩苷提取率在18～25 mL/g時黃芩苷提取率達到最大，當液固比一定時，黃芩苷提取率隨著提取時間的延長在12～17 min達到最大；當提取溫度一定時，液固比在(18～25):1(mL:g)時黃芩苷提取率達到最大，當液固比一定時，黃芩苷提取率隨提取溫度上升在76～90℃達到最大。

圖4 響應面實驗結果

2.3.4 驗證實驗結果 結合單因素實驗結果，通過響應面軟件分析可知，黃芩苷提取實驗最終的優化工藝參數為提取時間15.63 min，提取溫度83.48℃，液固比為21.07:1(mL:g)時黃芩苷有最高得率為67.175 mg/g。結合實際情況，調整工藝條件為提取時間16 min，提取溫度85℃，液固比20:1(mL:g)，平行實驗3次取平均值，黃芩苷提取率為66.99 mg/g，與預測結果基本一致，故該提黃芩苷的提取工藝參數可以用于實際。

2.4 抑菌實驗結果

由表6分析可知，黃芩苷對這2種菌均有抑菌效果。且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果大于大腸桿菌。隨著黃芩苷濃度的降低，抑菌圈直徑逐漸減小，其抑菌效果逐漸減弱。

表6 黃芩苷對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌抑菌效果

2.5 復合保鮮液對鮮肉保鮮的影響

2.5.1 pH隨貯藏時間的變化 由圖5可知，在1～5天時間內，5組樣品的pH均呈下降趨勢。可以看到，3組復合保鮮劑處理組的pH下降速度明顯低于2組對照組，表明該復合保鮮劑對鮮肉具有保鮮作用，能夠延緩鮮肉的腐敗作用。且經復合保鮮劑處理的3組樣品中，黃芩苷濃度越大，pH下降的速率越低，說明樣品對鮮肉的保鮮效果與復合保鮮劑中黃芩苷的濃度呈正相關。

圖5 pH隨貯藏時間的變化

2.5.2 過氧化值隨貯藏時間的變化 由圖6可知，在1～5天內，各組的過氧化值均呈上升趨勢。2～5天復合保鮮劑處理組和VC-Na組的過氧化值下降速度明顯低于空白對照組，表明該復合保鮮劑和VC-Na對鮮肉均具有保鮮作用。且經復合保鮮劑處理的3組樣品中，黃芩苷濃度越大，過氧化值上升速率越低，說明樣品對鮮肉保鮮效果與復合保鮮劑中黃芩苷的濃度呈正相關。

圖6 過氧化值隨貯藏時間的變化

2.5.3 揮發性鹽基氮隨貯藏時間的變化 由圖7可知，在1～5天時間內，各組樣品的揮發性鹽基氮值均呈上升趨勢。含0.20%和0.30%黃芩苷的復合保鮮劑與空白對照組對揮發性鹽基氮影響差異較大，表明含高濃度黃芩苷的復合保鮮劑能夠抑制蛋白質分解產生胺類和含氮物質。比較這2組揮發性鹽基氮的差異可知，2組復合保鮮劑組抑制蛋白質分解效果與黃芩苷濃度呈正相關。

圖7 揮發性鹽基氮隨貯藏時間的變化

3 討論

3.1 溶劑篩選

本研究首次應用低共熔溶劑提取商洛黃芩中黃芩苷，與張曉虎等[20]采用乙醇提取商洛黃芩葉中黃芩苷相比提取率提高了4.33%；與Wang等[21]制備的9種疏水性季銨鹽類DESs，微波輔助DESs提取黃芩中的黃芩苷，其中癸酸-四丁基氯化銨N4444-Cl（物質的量比為1:2）為最優提取溶劑實驗結果一致。王慧[18]合成了9種不同性質的DESs用于山西當地黃芩中黃芩苷的提取，實驗結果也表明當癸酸與四丁基氯化銨摩爾比為1:2時，黃芩苷有最高提取率。原因可能是癸酸和四丁基氯化銨與提取的黃芩苷之間能夠形成穩定的氫鍵[22-23]。低共熔溶劑與有機溶劑相比雖可提高提取物的提取率，但在實際的規模生產中具有一定的局限性，很難達到大規模的制備，且缺乏回收再生的方法，目前常用的再生方法主要包括大孔樹脂吸附、冷凍干燥、固相萃取等[24-26]，相比之下大孔樹脂吸附法具有操作簡單、成本低廉的優勢。

3.2 微波提取

本研究采用微波輔助低共熔溶劑提取黃芩中黃芩苷，能夠有效提高黃芩苷的提取率，比楊威[27]采用超聲波提取黃芩中黃芩苷提取率高1%。從而使商洛黃芩得到充分利用，將為商洛地區黃芩苷提取提供技術參考。與邵紅等[28]采用微波提取黃芩中的黃芩苷相比，本研究黃芩苷的提取率低2.7%，由于微波實驗設備的影響，本校實驗室沒有專門的微波提取儀器，在實驗過程中對于提取溫度的控制均采用人工水浴控制，因此難免會對實驗結果產生不利的影響。與韓建軍等[29]采用超聲-微波輔助提取黃芩中黃芩苷相比提取率降低了6.8%，由于超聲-微波法是將超聲和微波2種方法結合起來，既具備微波的優點，又同時具備超聲的空化效應、熱效應，能夠有效促進黃芩苷的提取[30]。因此在后續研究條件允許的情況下，可以考慮將2種提取方法結合起來達到更優提取效果。

3.3 抑菌實驗

黃芩苷提取液濃度為100mg/mL時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為10.3 mm和14.1 mm，與張曉虎等[31]提取黃芩中的漢黃芩素對比，發現在相同濃度下，黃芩苷對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于漢黃芩素。有學者將黃芩苷復配微生物制備防腐保鮮液用于食品保鮮[32]，可為后續研究提供新思路。本研究只是在實驗室進行黃芩苷的提取工藝，未對黃芩苷進行分離和純化，只是對商洛黃芩粗提液進行了簡單的抑菌實驗研究和鮮肉保藏實驗，因此在一定程度上可能會影響黃芩苷的抑菌效果[33]，后續對黃芩苷的分離純化的工藝有待進一步研究。

3.4 保鮮應用

近年來，開發植物源天然保鮮防腐劑用于食品保鮮已成為食品防腐劑的熱點之一[34-35]。Rafaela等[2]比較了黃芩提取液與其他中藥提取液對不同真菌的抑制作用，通過將黃芩提取液涂抹在紙質包裝袋上，在一定條件下用于饅頭的保鮮。結果顯示黃芩提取液對真菌的抑制作用強于其他中藥提取液，且用含黃芩提取液的包裝袋包裝饅頭能有效延長饅頭貯藏期。李霞等[36]將9種香辛料應用于豆筋的保鮮，結果顯示八角、丁香及辣椒對豆筋的保鮮效果最佳，能夠有效延長豆筋的貯藏期。

4 結論

實驗最終選取DES-1為提取溶劑，得到黃芩苷最佳提取工藝參數，即提取時間16 min、液固比20:1(mL:g)、提取溫度85℃,黃芩苷有最高得率為66.99 mg/g。黃芩苷對金黃色葡萄球菌的抑菌效果大于大腸桿菌。黃芩苷濃度為100 mg/mL時，金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為14.1 mm，大腸桿菌為10.3 mm。隨著黃芩苷濃度的降低，其抑菌效果逐漸減弱，抑菌圈直徑逐漸減小。含有黃芩苷的復合保鮮劑能夠有效降低pH的下降速率以及過氧化值和揮發性鹽基氮的上升速率，能夠有效抑制鮮肉脂肪的氧化與蛋白質的分解，且隨著含黃芩苷濃度的增大，保鮮效果提高。