微量生物檢材定量檢測靈敏度的評估與應用

李翹

麗水市人民醫院司法鑒定所 浙江 麗水 323000

引言

在實際工作中我們會碰到一些微量生物檢材，如何高效地對微量檢材進行DNA檢驗，成功獲得正確的STR分型，成為法醫學工作面臨的難題[1]。在一般情況下，進行STR分型要求樣品濃度在1.0ng/ul或者濃度介于0.5ng-1.5ng/ul范圍之內以獲得較優的分型結果，DNA量過少會造成部分 STR 基因座分型結果的缺失，甚至擴增失敗。本文探索并且構建微量生物檢材可獲得有效STR分型結果的靈敏度，通過此靈敏度對檢案中的微量生物檢材檢驗進行指導，并靈活調整常規PCR擴增方案，從而提高DNA檢驗的科學性和有效性。

1 材料與方法

1.1 樣本

采用試劑盒中的007標準品進行定量稀釋。

1.2 儀器與試劑

GlobalFiler?試劑盒（ABI公司，美國）、3500XL基因分析儀（ABI公司，美國）、9700型擴增儀（ABI公司，美國），QS5熒光定量儀（ABI公司，美國）。

1.3 實驗方法

利用QS5定量擴增儀對007標準品進行定量，然后進行梯度稀釋，稀釋的濃度分別為10pg、20pg、40pg、60pg、80pg、100pg、200pg、500pg。擴增產物用3500XL型基因分析儀進行電泳分離，STR分型結果使用GeneMapper ID-X v1.5進行分析。

方法一：采用Globalfiler試劑盒標準體系25ul、標準程序29循環，分別用10pg、20pg、40pg、60pg、80pg、100pg、200pg、500pg的濃度平行擴增五次，分析結果。

方法二：采用Globalfiler標準體系25ul、擴增程序優化至30循環和32循環，分別用40pg、60pg、80pg的濃度平行擴增五次，分析結果。

方法三：采用Globalfiler常規體系10ul、標準程序29循環，分別用16pg(相當于25ul中40pg)、40pg(相當于25ul中100pg)的濃度平行擴增五次，分析結果。

PCR 擴增參數：95℃ 1min；94℃ 10s，59℃ 90s，共 29 個循環；60℃ 10min；4℃保持。

2 結果

以分型峰高＞50RFU為標準進行數據分析。實驗結果按照同一基因座出現該峰3次以上的統計原則進行綜合分析后與已知對照比對確定分型。分型效果分析指標采用“檢出率”(等位基因出現的總條帶數/預計等位基因總條帶數)和“非特異性擴增率”（出現非特異性擴增的位點/24 個位點×5 次實驗）來評價[1]。

2.1 標準體系標準程序的結果

分別用10pg、20pg、40pg、60pg、80pg、100pg、200pg、500pg的濃度平行擴增五次，實驗結果表明，隨著濃度的增加，檢出率逐漸提高，100pg五次重復實驗中有3次等位基因完全檢出，有2次各丟失一個等位基因。200pg和500pg五次重復中，等位基因完全檢出。

表1 標準體系標準程序的檢驗結果

2.2 標準體系循環次數的優化

增加循環數至30循環和32循環，分別用40pg、60pg、80pg的濃度平行擴增五次，實驗結果表明隨著循環數的增加，30循環和32循環的檢出率明顯提高，且32循環的檢出率要高于30循環的檢出率，但非特異性擴增率也高于30循環。

表2 標準體系增加循環的檢驗結果

2.3 10ul體系標準程序的結果

10ul體系中分別用16pg(相當于25ul中40pg)、40pg(相當于25ul中100pg)的濃度平行擴增五次，實驗結果表明按比例減少擴增體系及模板DNA的量，檢出率也會隨之降低。

表3 10ul體系標準程序的結果比較

3 討論

目前市面上的試劑盒推薦擴增體系都是25ul，在實際檢案中，不少實驗室用的是 10ul的擴增體系，甚至更小。本文采用GlobalFiler?試劑盒推薦的擴增體系25ul進行了微量生物檢材可獲得有效STR分型結果的靈敏度初步研究，并通過調整循環參數和改變擴增體系進行了比較分析。

由本實驗結果可以看出，采用試劑盒推薦的25ul擴增體系標準程序進行不同濃度的擴增時，隨著模板DNA量的增加，檢出率也會提高，當模板DNA量達到100pg時，5次重復實驗中有3次獲得完整分型，2次丟失一個等位基因，檢出率為99.1%。當模板DNA量在20pg及其以下時，檢出率不足50%，無法獲得有效分型，故而選取40pg、60pg、80pg的濃度進行循環參數的優化比較。

當增加至30循環時，40pg、60pg、80pg的檢出率由原來的74.9%、84.2%、95.3%分別提高至82.3%、89.8%、95.3%；當增加至32循環時，檢出率提高至86.5%、93.5%、98.1%。同時，非特異性擴增率也隨著循環數的增加而提高，并且從圖譜分析，循環數增加后帶來的等位基因不平衡擴增現象更明顯，這些都會造成分型數據分析的困擾。韓俊萍[2]等人研究發現，當循環數增加至 34 次時，非特異性擴增增加同時等位基因丟失增多，這是由于循環數增多，小片段優先擴增，大片段的擴增產物少，使得等位基因丟失反而增多，故循環數不是越多越好。吳微微[3]等人研究發現循環次數增加過多，會產生峰值不平衡或等位基因丟失的現象，建議在日常檢案中，慎用 34次及以上循環次數。本文中未對34循環進行研究探討，是因為增加循環數固然會提高檢出率，但隨之帶來的非特異性擴增和不平衡擴增現象會嚴重影響微量物證分型結果的判讀，結合實驗結果本文認為循環數不宜超過32循環。

當采用10ul體系標準程序擴增時，在10ul反應體系中加入16pg和40pg的模板DNA就相當于25ul反應體系中加入40pg和100pg的模板DNA，檢出率分別為54.0%、75.8%和74.9%、99.1%。明顯看出，在相對DNA含量一樣的前提下，25ul體系的檢出率明顯提高。這是因為小體積的擴增體系即使是按比例減少擴增體系的體積，依然會造成擴增條件的改變，出現同一基因座兩個等位基因的偏差、等位基因丟失等現象，因此對于極微量檢材，應該避免使用小體積的擴增體系[4]。

綜上，根據本文研究，當模板DNA量在20pg以下時，分型成功率比較低，不足50%。當然，本文研究使用的模板DNA為標準品007，其質量均優于實際檢案中提取到的模板DNA，所以建議實際工作中，如果定量后模板DNA量在20pg以下時，即可停止后續擴增檢測。在20pg以上時，可以通過標準體系適當增加循環擴增來獲得理想分型。對于定量后模板DNA量在20pg以上的微量DNA，除了無水擴增保證模板量外，還可以采用25ul體系增加至30循環（最多不超過32循環）的方法來平行擴增提高分型成功率。