基于在位光還原銀膠法的核酸堿基快速檢測

申浩 申慧彬

摘要：核酸遺傳物質(zhì)是蛋白質(zhì)合成過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)生物遺傳和變異起著關(guān)鍵性作用。核酸堿基多樣性特點(diǎn)決定了堿基反應(yīng)性能，進(jìn)而發(fā)生生物進(jìn)化和衰老。組合核酸堿基能夠得到足夠多的信息，是形成高分子生物物質(zhì)的基礎(chǔ)。因此，提出了基于在位光還原銀膠法的核酸堿基快速檢測。制備表面增強(qiáng)拉曼光譜常規(guī)基底，準(zhǔn)備核苷酸、核苷、堿基實(shí)驗(yàn)材料。制備核酸堿基、硝酸銀溶液、銀膠溶液和銀膜，測量拉曼光譜。使用激光誘導(dǎo)獲取銀基質(zhì)，利用NaCIO4分子的CI-O鍵振動(dòng)作為內(nèi)標(biāo)，分析在位光還原合成銀膠法增強(qiáng)光譜效果。由分析結(jié)果可知，該方法可以獲得高信噪比的表面增強(qiáng)拉曼光譜，且具有良好穩(wěn)定性，在核酸堿基低濃度檢測方面具有實(shí)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：在位光還原;銀膠法;核酸堿基;檢測

中圖分類號(hào)：T0041⁺.7 文獻(xiàn)識(shí)別碼：A 文章編號(hào)：1001—5922（2021）02—0041—05

0引言

利用焦磷酸序列測定和等位基因特異性擴(kuò)增方法，可以快速檢測核酸堿基。在DNA鏈擴(kuò)增和延展過程中，焦磷酸測序是一種基于實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測熒光變化以確定核酸序列的技術(shù)。在PCR擴(kuò)增完成之后，擴(kuò)增DNA鏈。脫氧核苷酸和4種特殊酶共同參與DNA序列測定，三磷酸腺苷的作用是消除單個(gè)脫氧核苷酸，并不與DNA鏈相連，從而避免釋放單個(gè)脫氧核苷酸產(chǎn)生的熒光對(duì)信號(hào)收集造成的影響，根據(jù)熒光未知的DNA序列讀取信號(hào)，完成核酸堿基檢測。此方法無需人工操作，可準(zhǔn)確判斷單基突變類型，實(shí)現(xiàn)定量檢測。但也存在著僅能測量短序列DNA的問題;利用等位基因特異性擴(kuò)增的方法，設(shè)計(jì)兩種PCR引物，其中一種與目標(biāo)突變體DNA完全互補(bǔ)，或者出現(xiàn)單堿基錯(cuò)配，另一種是引物設(shè)計(jì)正常。反應(yīng)分為兩組實(shí)驗(yàn)，在遇到不匹配的堿基引物時(shí)，DNA無法繼續(xù)延伸。如在待測基因型中有突變，則在跑膠后會(huì)出現(xiàn)突變擴(kuò)增帶，而在待測基因型中未發(fā)生突變現(xiàn)象，那么就不會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增帶，通過這兩種現(xiàn)象確定是否存在突變序列。盡管該方法的優(yōu)點(diǎn)是簡單、快速、低成本，但它也存在由于引物只有一個(gè)基點(diǎn)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)放大不正常而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確的缺陷。

為解決上述問題，提出了一種利用在位光還原銀膠法快速檢測核酸堿基的方法。采用激光誘導(dǎo)光還原法制備銀膠增強(qiáng)基的拉曼光譜信號(hào)，并利用拉曼散射增強(qiáng)法對(duì)低濃度分子進(jìn)行檢測。

1表面增強(qiáng)拉曼光譜常規(guī)基底制備

1.1拉曼光譜分析

拉曼光譜能夠反映出分子結(jié)構(gòu)特征，其光譜振動(dòng)是一個(gè)相對(duì)薄弱的環(huán)節(jié)，拉曼光譜散射光強(qiáng)通常只有10-10。常規(guī)拉曼光譜的信號(hào)強(qiáng)度特別低，激光激發(fā)分子產(chǎn)生拉曼散射信號(hào)時(shí)，常伴有熒光信號(hào)。根據(jù)以上特點(diǎn)，需要對(duì)某些物質(zhì)進(jìn)行增強(qiáng)效應(yīng)研究。

拉曼信號(hào)的增強(qiáng)主要有兩種方法：一種是以激光作激勵(lì)光源，其波長與被電子測量物質(zhì)的吸收波長相近或相等，從而提高被測量物質(zhì)的拉曼轉(zhuǎn)換概率;另一種是提高分子的拉曼散射截面振動(dòng)模式，能夠增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)，這就是所謂的共振拉曼效應(yīng)，但是該效應(yīng)并不具有表面的特異性，并且溶液中的同種物質(zhì)可能嚴(yán)重干擾拉曼光譜增強(qiáng)效果;而表面增強(qiáng)拉曼光譜增強(qiáng)效應(yīng)是一種選擇性增強(qiáng)技術(shù)，可以檢測單分子信號(hào)。

1.2常規(guī)基底制備

活化基底的制備一直是表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測技術(shù)發(fā)展的重要因素，對(duì)擴(kuò)大應(yīng)用效果有重要意義。基片的表面增強(qiáng)拉曼光譜效應(yīng)與基底的表面強(qiáng)度有密切關(guān)系，但僅能在少數(shù)基底表面上觀測到。由于對(duì)分子的拉曼信號(hào)具有很大的增強(qiáng)作用，銀被用作表面增強(qiáng)拉曼光譜底物。在顯微鏡下觀察銀面粗糙度，一般可分為3種類型：①宏觀粗糙度，銀表面的顆粒尺寸在20-500nm之間;②亞微觀粗糙度，銀表面的顆粒尺寸在5～20nm之間;③微觀粗糙度，銀表面顆粒尺寸小于5nm。銀表面顆粒粗糙度大于激發(fā)光波長，將不會(huì)引起拉曼譜效應(yīng)，但是還沒有確定最佳表面粗糙度。一般而言，在50-100nm范圍內(nèi)，粗糙度的提高最大，最佳粗糙度的形成是由于吸附原因造成的，其中大多數(shù)是亞微和微細(xì)顆粒的形成。

表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)基底應(yīng)具有表面增強(qiáng)效應(yīng)強(qiáng)、基底穩(wěn)定性高、保存期長等優(yōu)點(diǎn)，表面增強(qiáng)拉曼光譜常規(guī)基底制備是表面增強(qiáng)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究課題。使用金屬溶膠法，其是表面增強(qiáng)拉曼散射活性基底之一，由于其制備工藝簡單，不需特殊處理，存儲(chǔ)方便，增強(qiáng)效果好，所以被選擇作為表面增強(qiáng)拉曼散射基底。目前金屬溶膠的制備通常采用氧化還原、光化學(xué)還原和電化學(xué)還原方法，在這些方法中，氧化還原法最為常用。利用檸檬酸鈉來還原硝酸銀來制備銀膠，該過程也是使用硼氫化鈉來還原硝酸銀，并根據(jù)溶膠基體制備條件，以銀膠為基體，研究了和生物分子表面增強(qiáng)拉曼譜，并在銀基體上檢測到拉曼信號(hào)。

核酸堿基是核酸的重要組成成分，從堿基基本組成原子上分析，其主要包括氫、碳、氮、氧等元素，這決定了堿基的多種反應(yīng)性質(zhì)。堿基會(huì)發(fā)生一些化學(xué)反應(yīng)，如烷基化，鹵化，反硝化，氰化或加氧。正是因?yàn)檫@些反應(yīng)，像儲(chǔ)存和傳遞信息這樣的生命事件才會(huì)發(fā)生。由于核酸堿基種類較多，通過不同組合模式能夠得到足夠多的的信息。

由于堿基類型的多樣性，通過適當(dāng)?shù)慕M合可以得到足夠多信息。

2基于在位光還原銀膠法的核酸堿基快速檢測實(shí)驗(yàn)

2.1實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)材料選擇如表1所示。

將堿基、核苷及核苷酸固體粉末放置在載玻片上，改善玻璃蓋壓平，并放置在顯微鏡下調(diào)整焦距。借助拉曼光譜儀檢測樣品。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1核酸堿基、硝酸銀溶液制備與拉曼光譜測量

1）將含有腺嘌呤A、胞嘌呤C、鳥嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶u的核酸堿基溶液注入經(jīng)過凈化系統(tǒng)處理的水中，混合成1×10^-5mol/L溶液。

具體配置流程為：

分別將過量的A、c、G、T、u溶解于5mL水中，將其稀釋成吸收值為0.5-1之間的溶液，根據(jù)核苷酸分子中不同堿基吸光系數(shù)計(jì)算飽和溶液，最后將核苷酸分子濃度稀釋，得到1×10^-5mol/L溶液。在稀釋過程中，將各種樣品放置在50%水中溶解一天，能夠完全溶解樣品。

2）硝酸銀溶液制備：將硝酸銀溶液溶于凈化系統(tǒng)處理后的水中，配制成lmol/L溶液，并依次稀釋配制成O.1mol/L，O.01mol/L和0.001mol/L硝酸銀溶液。

3）拉曼光譜測量：將制備的核酸堿基溶液與濃度分別為lmol/L、0.1mol/L、0.01mol/L和0.00lmoYL硝酸銀溶液混合，倒入內(nèi)徑為0.5mm的石英毛細(xì)管之中，使用顯微拉曼光譜儀對(duì)樣品檢測，激發(fā)光譜波長為500nm，樣品照射功率為5mW，曝光時(shí)間為15s，迭代次數(shù)為15次，由此完成拉曼光譜檢測。

2.2.2銀膠溶液制備與拉曼光譜測量

1）銀膠溶液制備：利用檸檬酸三鈉C6H5Na3O7·2H2O還原硝酸銀制備銀膠溶液，將80mg硝酸銀溶于600mL水中，并加熱到水沸騰，然后將1%C6H5Na3O7·2H2O水溶液沿著杯壁緩慢滴人硝酸銀溶液中，始終保持溶液處于沸騰狀態(tài)。使用攪拌棒快速、持續(xù)攪拌，再靜置90min后取出，并將其放在低溫避光位置處保存?zhèn)溆谩?/p>

在銀膠溶液制備過程中，為了檢測銀膠顆粒，需使用紫外監(jiān)測圖譜，隨著時(shí)間變化，最大吸收峰位置發(fā)生改變，峰位先出現(xiàn)向最大吸收峰向長波長方向移動(dòng)，后又出現(xiàn)向最大吸收峰向短波長方向移動(dòng)，由此得到大小均勻的銀膠顆粒。為了證明該結(jié)論，需進(jìn)行掃描電鏡實(shí)驗(yàn)，如果掃描結(jié)果中銀膠顆粒大小在50nm～100nm之間，則說明銀膠顆粒是均勻顆粒。

2）拉曼光譜測量：將1×10^-5mol/L核酸堿基溶液與銀膠溶液混合，倒入內(nèi)徑為0.5mm的石英毛細(xì)管之中，該拉曼光譜測量條件與銀膠溶液制備拉曼光譜測量條件一致。

2.2.3銀膜制備與拉曼光譜測量

1）銀膜制備：使用電子蒸鍍機(jī)蒸鍍銀，并將獲得的銀膜低溫避光保存。

2）拉曼光譜測量：為保證核酸堿基溶液制備、硝酸銀溶液制備及銀膠溶液制備拉曼光譜測量堿基一致，需先將1×10^-5mol/L核酸堿基溶液稀釋后直接滴在銀膜表面，再使用顯微拉曼光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行拉曼光測量。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

將O.1mol/L核酸堿基溶液及1×10^-5mol/L核酸堿基溶液混合，放置在激光波長為480nm，功率大小為0.5W激光下照射，充足照射30min后，在lmL吸水池中使用光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行紫外可見光掃描，得到的掃描結(jié)果如下。

在銀膠溶液合成過程中，使用光還原方法獲得銀膠溶液，這種方法合成的銀基質(zhì)可以得到高信噪比的表面增強(qiáng)拉曼光譜，因此，使用激光誘導(dǎo)獲取銀基質(zhì)。

將不同濃度硝酸銀和腺嘌呤溶液混合，利用NaCl04分子的C1-O鍵振動(dòng)作為內(nèi)標(biāo)，研究混合溶液拉曼信號(hào)增強(qiáng)效果，如圖1所示。

圖1中：a、b、c、d分別表示0.5mol/L、5mol/L、50mol/L、500mol/L銀離子濃度。在沒有銀離子存在的情況下，由A、c、G、T、u核酸堿基溶液測量拉曼光譜信號(hào)較弱，很難發(fā)現(xiàn)特征譜峰。

當(dāng)銀離子濃度升高時(shí)，核酸堿基拉曼光譜信號(hào)得到了顯著提高，從光譜中可以發(fā)現(xiàn)其有各自峰值。在一定銀離子濃度條件下，核酸堿基混合溶液在激光誘導(dǎo)情況下能夠發(fā)生光反應(yīng)，并制備銀膠體，由此產(chǎn)生拉曼光譜表面增強(qiáng)效果。

為了研究核酸堿基溶液在銀離子作用下拉曼光譜位移變化原因，對(duì)腺嘌呤和銀離子混合溶液在激光照射下對(duì)拉曼光譜時(shí)間依賴性和激光強(qiáng)度依賴性展開分析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：在激光強(qiáng)度較低的情況下，拉曼峰值逐漸顯現(xiàn)出來，由此獲得拉曼信號(hào)。核酸堿基拉曼信號(hào)增強(qiáng)主要原因是當(dāng)銀離子經(jīng)過激光誘導(dǎo)后，被還原成銀顆粒，由此增強(qiáng)核酸堿基拉曼信號(hào)。由圖2（b）可知，混合溶液拉曼信號(hào)強(qiáng)度和位置都沒有出現(xiàn)明顯變化，足以證明銀離子光還原性表面增強(qiáng)拉曼光譜具有一定穩(wěn)定性。

為了驗(yàn)證在位光還原銀膠法制備的表面增強(qiáng)譜具有良好穩(wěn)定性，需將拉曼光譜峰值、紫外可見光譜峰值與理論峰值進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果如表2所示。

由表2可知：在三次迭代次數(shù)下，5種核苷酸分子拉曼光譜峰值與理論峰值基本一致，只是在腺嘌呤1次迭代;胞嘧啶3次迭代;鳥嘌呤2、3次迭代;尿嘧啶1次迭代情況下出現(xiàn)偏差，而在其它迭代次數(shù)下均一致。而紫外可見光譜峰值與理論峰值相差較大，由此可知，在位光還原銀膠法制備的表面增強(qiáng)譜具有良好穩(wěn)定性。

4結(jié)語

對(duì)拉曼散射光譜、紫外可見光譜進(jìn)行了綜合分析，結(jié)果表明，在Ag+溶液體系中，拉曼散射光譜信號(hào)增強(qiáng)是由于銀原子的表面增強(qiáng)所致，而這種增強(qiáng)來自于堿基分子的光還原。經(jīng)多次測量，拉曼散射光譜的位置和強(qiáng)度都有較大變化。研究發(fā)現(xiàn)，在位光還原銀膠法制備的表面增強(qiáng)譜具有良好穩(wěn)定性。

核酸堿基的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測還處于較初步的階段，希望能有足夠的時(shí)間對(duì)其結(jié)構(gòu)影響和核酶變過程進(jìn)行監(jiān)測。該技術(shù)可以監(jiān)測核酶的切割過程，為核酸堿基結(jié)構(gòu)形成過程中的折疊過程分析提供數(shù)據(jù)支持。