冠心病患者循環(huán)lnc RNA Novlnc6表達及其與預后的相關(guān)性研究

陳雪梅 張玲

(漢中市人民醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 漢中 723000)

冠心病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病[1-3]。藥物治療仍然是冠心病的主要治療策略之一，但藥物治療的應用受到藥物耐受性的不良副作用的挑戰(zhàn)[4-5]。因此，鑒定用于診斷冠心病的生物標志物對于改善冠心病的早期治療具有重要意義。長非編碼RNA(lncRNA)是一組含有超過200個核苷酸的非編碼RNA。眾所周知，lncRNAs幾乎在人體的所有生物過程中都具有關(guān)鍵作用[6-7]。 LncRNA也被證明在各種人類疾病的發(fā)展和進展中發(fā)揮重要作用，包括不同類型的癌癥，肝臟疾病和心臟病。Novlnc6作為lncRNA的成員，主要在心肌細胞以及內(nèi)皮細胞中表達，并且在骨形態(tài)發(fā)生蛋白10(BMP10)的表達中具有調(diào)節(jié)作用，并且Novlnc6也被發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死進展中具有必要的功能，此外Novlnc6被證明能夠調(diào)節(jié)血管生長和功能[8-9]。本研究擬探討冠心病患者循環(huán)lnc RNA Novlnc6表達及其與預后的相關(guān)性研究，為冠心病的診治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年12月至2017年9月在我內(nèi)科確診的冠心病患者96例為病例組，確診。按照是否發(fā)生急性冠狀動脈綜合征分為穩(wěn)定性冠心病組47例，急性冠脈綜合征組49例。同期選擇本院門診正常體檢者86例為對照組。冠心病組男50例，女46例，平均年齡(56.78±21.85)歲，平均病程(9.93±5.64)年，平均收縮壓(126.74±19.35)mmHg，平均舒張壓(79.74±14.91)mmHg，BMI(22.71±2.80)Kg/m2，吸煙45例，飲酒40例；對照男45例，女44例，平均年齡(57.24±19.14)歲，平均收縮壓(123.55±22.56)mmHg，平均舒張壓(76.56±12.65)mmHg，BMI(22.65±2.72)Kg/m2，吸煙39例，飲酒35例。納入標準：符合《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病診斷標準(WS319-2010)》，經(jīng)實驗室檢查(S-T段異常壓低，一過性S-T段抬高，明顯的S-T段壓低和T波倒置等)及臨床表現(xiàn)(突感心前區(qū)疼痛，疼痛從胸骨后或心前區(qū)開始，向上放射至左肩、臂，甚至小指和無名指，休息或含服硝酸甘油可緩解)。排除標準：孕婦或近3個月有手術(shù)、創(chuàng)傷史。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審批，患者及家屬均知情同意。

1.2方法

1.2.1血清lnc RNA Novlnc6水平的測定 使用TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)試劑盒根據(jù)制造商的方案分離總RNA。 使用QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen)合成cDNA。 使用Hairpin-itTM qRT-PCR Primer Set(GenePharma Co.Ltd.，Shanghai，China)測定lnc RNA Novlnc6相對表達量，將U6 mRNA水平作為標準化為內(nèi)源性參考。通過SYBR green qRT-PCR測定(Takara)測量lnc RNA Novlnc6。 各引物序列如下：lnc RNA Novlnc6正向，5′-ACACTCCAGCTGGGCTGAAGTGATGTGTAA-3′和反向，5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′; U6正向，5′-CCCCTGGATCTTATCAGGCTC-3′和反向，5′-GCCATCTCCCCGGACAAAG-3′。使用2-ΔΔCq方法確定表達量。qPCR循環(huán)條件為：一個循環(huán)為95℃，30 s；40個循環(huán)：95℃為15 s，60℃為30 s，72°C，持續(xù)30 s。所有實驗均為重復三次以使其可靠。

1.2.2常規(guī)臨床指標的測定 病例組(入院后6 h)及對照組(清晨空腹)肱靜脈抽血；取靜脈血10 mL置于無菌管中，室溫靜置30 min，3000 rpm離心,10 min，分離血清，貝克曼AU-480全自動生化分析儀測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、肌酐(Crea)、尿酸(uric acid)。酶標儀測定hs-CRP。德國西門子 Acuson SequoiaC512 型彩色多普勒超聲診斷儀檢測患者左室射血分數(shù) (LVEF)。

1.2.3隨訪 出院后每月定期電話隨訪，記錄所有患者出院后的主要心臟不良事件(非致死性心肌梗死、死亡、血運重建等情況)

2 結(jié) 果

2.1對照組、冠心病組組別間各指標水平比較 與對照組比較，冠心病組Crea、TC、TG、LDL-C、FIB、Uric acid、hs-CRP水平升高，lnc RNA Novlnc6、HDL-C、LVEF水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 對照組、冠心病組組別間各指標水平比較

2.2穩(wěn)定性冠心病組、急性冠脈綜合征組組別間各指標水平比較 與穩(wěn)定性冠心病組比較，急性冠脈綜合征組Crea、TC、TG、LDL-C、FIB、Uric acid、hs-CRP水平升高，lnc RNA Novlnc6、HDL-C、LVEF水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 穩(wěn)定性冠心病組、急性冠脈綜合征組組別間各指標水平比較

2.3lnc RNA Novlnc6與各指標的相關(guān)性分析 lnc RNA Novlnc6與HDL-C、LVEF正相關(guān)關(guān)系明顯，與Crea、TC、TG、LDL-C、FIB、Uric acid、hs-CRP負相關(guān)關(guān)系明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 lnc RNA Novlnc6與各指標的相關(guān)性分析

2.4lnc RNA Novlnc6表達水平與冠心病患預后分析 lnc RNA Novlnc6高表達組主要心臟不良事件、死亡、非致死性心肌梗死、血管重建、再狹窄、新發(fā)狹窄發(fā)生率低于lnc RNA Novlnc6低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 lnc RNA Novlnc6表達水平與冠心病患預后分析

2.5冠心病患者發(fā)生不良預后事件的多元Logistic回歸分析 以冠心病患者發(fā)生不良預后事件(主要心臟不良事件、死亡、非致死性心肌梗死、血管重建、再狹窄、新發(fā)狹窄)為應變量(是=1，否=0)，單因素分析有意義的因素為自變量進行多因素Logistic逐步回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高水平的Crea及低水平的lnc RNA Novlnc6、HDL-C均為冠心病患者發(fā)生不良預后事件的危險因素(OR=2.43、4.26、13.62，P<0.05)。見表5。

表5 冠心病患者發(fā)生不良預后事件的多元Logistic回歸分析

3 討 論

冠心病的治療受到長期應用化學品期間產(chǎn)生的藥物耐受性和高復發(fā)率的挑戰(zhàn)。因此，迫切需要早期診斷和及時治療以促進冠心病的治療功效。可用于反映某些疾病的身體狀況和高風險的生物標志物已廣泛用于診斷各種人類疾病，包括冠心病。研究表明，血漿lncRNA coroMarker在冠心病診斷中的敏感性可達78.05%，特異性可高達91.89%，表明該lncRNA可能作為冠心病診斷的生物標志物。MicroRNA(miRNA)也是一組非編碼RNA[10]。與lncRNA不同，miRNA的長度通常約為22 nt。研究發(fā)現(xiàn)miR-17/92a簇、miR-106b/25、miR-126 、miR-21/590-5p家族和miR-451都在冠心病的開發(fā)中具有重要作用；除了RNA之外，還發(fā)現(xiàn)TLR3和TLR4蛋白的表達水平與冠心病的嚴重程度密切相關(guān)；最近的一項研究表明，隨著冠心病嚴重程度的增加，冠心病中血漿中親環(huán)素A(CyPA)分泌的氧化應激水平增加，經(jīng)適當處理后下降，因此CyPA的上調(diào)表達可作為冠心病診斷指標。然而，這些生物標志物的應用仍然受到個體檢測差異的限制。因此，仍然需要更多的生物標志物。

眾所周知，lncRNA參與心臟病的進展。隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)多種lncRNA的表達與冠心病相關(guān)[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，6個單核苷酸多態(tài)性(SNP)與lncRNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MIAT)相關(guān)，與心肌梗死的發(fā)生率呈正相關(guān)。LncRNAs通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達參與心臟事件[14]。心臟功能在很大程度上取決于鉀通道的正確活性，研究表明，作為鉀通道編碼基因的鉀電壓門控通道亞家族Q成員1(Kcnq1)的轉(zhuǎn)錄受lncRNA Kcnq1ot1表達的調(diào)控；INK4基因座中的lncRNA反義非編碼RNA或人類染色體9p21上的CDKN2B-AS1(ANRIL)是第一個被證明能夠促成冠心病易感性的lncRNA。 ANRIL可以募集胞質(zhì)分裂蛋白1(PRC1)和PRC2的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)INK4b-ARF-INK4a簇中基因的表達，從而調(diào)節(jié)冠心病和不同類型癌癥的進展[15-16]。 LncRNA Novlnc6是一種新鑒定的心臟特異性lncRNA，在心臟發(fā)育和心臟病發(fā)病機制中具有潛在功能。據(jù)報道Novlnc6能夠調(diào)節(jié)Nkx2.5的表達，這是一種關(guān)鍵的心臟轉(zhuǎn)錄因子，而心肌細胞中Novlnc6的敲低可以顯著抑制心臟發(fā)生。此外，在擴張型心肌病患者中，Novlnc6的表達總是被發(fā)現(xiàn)下調(diào)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，Novlnc6可調(diào)節(jié)miR-21和PTEN的表達以抑制心臟纖維化，提示Novlnc6可能在心臟病中發(fā)揮保護作用；mTOR途徑在冠心病的發(fā)展中起著不可或缺的作用，mTOR信號通路的激活可以啟動冠心病患者的單核細胞促炎反應，促進這種疾病的進展。已經(jīng)證明抑制該通路是改善冠心病的有效策略。研究發(fā)現(xiàn)，Novlnc6的下調(diào)顯著增加了p-mTOR的水平，并且GAS5過表達顯著降低了p-mTOR的水平，表明Novlnc6可以抑制mTOR的活化。本次研究結(jié)果顯示，與對照組比較，冠心病組lnc RNA Novlnc6水平降低；與穩(wěn)定性冠心病組比較，急性冠脈綜合征組lnc RNA Novlnc6水平降低。這與上述討論符合，說明冠心病患者循環(huán)lnc RNA Novlnc6水平降低。相關(guān)分析顯示，lnc RNA Novlnc6與HDL-C、LVEF正相關(guān)關(guān)系明顯，與Crea 、TC、TG、LDL-C、FIB、Uric acid、hs-CRP負相關(guān)關(guān)系明顯。預后分析顯示，lnc RNA Novlnc6高表達組主要心臟不良事件、死亡、非致死性心肌梗死、血管重建、再狹窄、新發(fā)狹窄發(fā)生率低于lnc RNA Novlnc6低表達組。這說明冠心病患者循環(huán)lnc RNA Novlnc6高表達者預后良好，說明冠心病患者循環(huán)lnc RNA Novlnc6水平降低。而多因素Logistic逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)高水平Crea及低水平lnc RNA Novlnc6、HDL-C為冠心病患者發(fā)生不良預后事件的危險因素。這提示Novlnc6低表達能促進冠心病進展，低水平的lnc RNA Novlnc6為冠心病患者發(fā)生急性冠狀動脈綜合征的危險因素。

綜上所述，冠心病患者循環(huán)lnc RNA Novlnc6水平降低，Novlnc6低表達能促進冠心病進展；冠心病患者循環(huán)lnc RNA Novlnc6高表達者預后良好，低水平的lnc RNA Novlnc6為冠心病患者發(fā)生不良預后事件的危險因素。