丁苯酞聯合肢體缺血后處理對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用#

陽昀 程超 張沖 唐園燕 廖小明 周茜

（桂林醫學院第二附屬醫院神經內科，廣西 桂林 541199）

2009年，Ren等人首次證實肢體缺血后處理（Limb ischemic postconditioning，LPostC）可減輕腦缺血再灌注損傷[1]。自此，隨著研究的深入這一結論被眾多國內外學者證實[2]，且由于其安全、操作簡單易于推廣，因此具有廣闊的臨床前景。本課題前期研究發現LPostC通過抵抗氧化應激、減輕血腦屏障損傷和抑制凋亡來發揮保護作用[3-5]。在多種動物模型及臨床研究中，丁苯酞（Dl-3-n-Butylphthalide，NBP）均被證實具有改善腦缺血再灌注損傷效果[6-8]，現已作為我國急性缺血性腦卒中診治指南推薦用藥。但目前未見NBP聯合LPostC治療缺血性腦卒中的相關報道。本實驗擬探討NBP聯合LPostC對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，以期為臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

丁苯酞膠囊（石藥集團恩必普藥業有限公司），DAB顯示試劑盒、Caspase-3兔多克隆抗體和Caspase-9兔多克隆抗體（碧云天生物技術公司）、SOD、MDA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），DD-2型雙極電凝器（北京東方神健醫療器械有限公司），752型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.1.2 動物與分組

SPF級雄性SD大鼠75只，體重250～280 g（由桂林醫學院動物實驗中心提供）。隨機分為假手術組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、肢體缺血后處理組（LPostC組）、丁苯酞（Dl-3-n-Butylphthalide，NBP）后處理組（NBP組）和同時予NBP+LPostC的聯合后處理組（NL組），每組15只。

1.1.3 大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型制備及治療

除假手術組外，所有大鼠均采用石蠟線栓法建立大腦中動脈缺血再灌注模型，具體如下：SD大鼠經腹腔注射10%水合氯醛300 mg·kg-1麻醉后，游離左側頸外動脈，用頭端蘸有石蠟的魚線（φ= 0.26 mm）從左側頸外動脈插入，深度約18～20 mm，栓塞左側大腦中動脈。缺血2 h后，將線栓拔出1 cm實現再灌注。

缺血2 h后，NBP組和NL組腹腔注射丁苯酞80 mg·kg-1，其余大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。LPostC組與NL組在再灌注同時，夾閉雙側股動脈5 min，再灌注5 min，反復循環3次后，再灌注24 h。

1.2 方法

1.2.1 神經功能評定

神經功能缺損評分：參照Longa等評分標準，各組隨機選取10只大鼠，分別于再灌注24 h后進行評分。0分：正常，無神經學征象；1分：動物不能完全伸展右前肢；2分：動物右側肢體癱瘓，行走時向右側轉圈，出現追尾現象；3分：動物行走向右側跌倒，或動物不能站立或動物打滾；4分：無自發活動，有意識障礙。神經功能缺損評分在1～3分為模型成功，0分和4分為模型不成功。

1.2.2 比色法測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）含量

再灌注24 h后，每組隨機選5只大鼠斷頭取腦，取梗死側大腦半球制成10%腦組織勻漿，以3000 r·min-1離心10 min、取上清液，BCA法測定蛋白濃度，按試劑盒說明書進行MDA和SOD測定。

1.2.3 免疫組化測定Caspase-3和Caspase-9表達

再灌注24 h后，各組隨機選取5只大鼠斷頭取腦，切取視交叉前后各2 mm厚的腦組織塊，經常規固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后切成厚5 μm薄片，采用免疫組化法檢測Caspase-3和Caspase-9的表達，胞核出現棕黃染色顆粒為陽性細胞。在10×40倍光學顯微鏡下，隨機計數3個視野陽性細胞數，算出平均值，即為每張切片陽性細胞數目。

1.3 統計學處理

采用統計學軟件SPSS 18.0對數據進行分析，所有數據均采用均數±標準差（±SD）表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）進行組間比較，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評定

Sham組大鼠術后24 h精神可，一般行為狀態正常，無神經功能缺損癥狀及體征, 評分0分。與Sham組相比，I/R組、NBP組、LPostC組和NL組均出現不同程度的偏癱，評分明顯升高（P＜0.05）。相較I/R組，NBP組、LPostC組及NL組神經功能評分降低（P＜0.05）；且NL組評分比NBP組和LPostC組更低。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分比較（±SD, n=10）

表1 各組大鼠神經功能評分比較（±SD, n=10）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05；與NBP組比較，◆P＜0.05；與LPostC組比較，?P＜0.05。

組別 神經功能評分 Sham組 0 I/R組 2.6±0.16* NBP組 1.7±0.15# LPostC組 1.8±0.0.2# NL組 1.2±0.13?Δ

2.2 腦組織勻漿中MDA含量和SOD活性的變化

與Sham組相比，I/R組腦組織中MDA含量明顯增加，SOD活性明顯降低（P＜0.05）；與I/R組比較，NBP組、LPostC組和NL組腦組織中MDA含量明顯減少，SOD活性顯著升高（P＜0.05）；與NBP組和LPostC組相比，NL組腦組織中MDA含量進一步減少，SOD活性進一步升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠腦組織中MDA含量、SOD活性的比較（±SD, n=5）

表2 各組大鼠腦組織中MDA含量、SOD活性的比較（±SD, n=5）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05；與NBP組比較，?P＜0.05；與LPostC組比較，ΔP＜0.05。

組別 MDA（nmol·mgprot-1） SOD（U·mgprot-1） Sham組 3.23±0.11 160.6±4.06 I/R組 6.21±0.22* 64.0±3.26* NBP組 3.96±0.12# 107.4±4.31# LPostC組 3.89±0.11# 107.8±4.77# NL組 4.63±0.19?Δ 121.8±2.89?Δ

2.3 各組大鼠腦組織Caspase-3和Caspase-9陽性細胞數

Sham組大鼠腦組織僅有少量陽性細胞表達；而與Sham組相比，I/R組陽性細胞表達數明顯增加（P＜0.05）。與I/R組相比，NBP組、LPostC組和NL組陽性細胞顯著減少（P＜0.05）；與NBP組和LPostC組相比，NL組抑制Caspase-3和Caspase-9表達程度更強（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠腦組織Caspase-3和Caspase-9陽性細胞情況（±SD，n=5）

表3 各組大鼠腦組織Caspase-3和Caspase-9陽性細胞情況（±SD，n=5）

組別 Caspase-3陽性細胞 （個·HP-1） Caspase-9陽性細胞 （個·HP-1） sham組 6.2±1.16 5.8±1.15 I/R組 47.4±2.46* 49.2±2.22* NBP組 20.0±1.58# 23.8±1.53# LPostC組 23.2±1.66# 24.4±1.65# NL組 14.6±1.44?Δ 15.8±1.36?Δ

3 討論

我國約70%卒中患者為缺血性腦卒中[9]，恢復缺血區域血流灌注是治療策略的重點；然而目前對于缺血再灌注損傷的發生仍是治療的難點，普遍認為其相關病理生理機制主要包括氧化應激（氧自由基大量產生）、炎性因子升高、細胞凋亡、血腦屏障破壞等[10-12]。本項研究表明，腦缺血再灌注損傷后，以MDA為代表的脂質過氧化產物大量生成，引發氧化應激反應；同時凋亡因子Caspase-3和Caspase-9活性顯著增強，誘導細胞凋亡發生；這與前人的研究結果一致。

多年來，眾多學者致力于探索減輕腦缺血再灌注損傷的藥物與措施。丁苯酞是我國自主研發的藥物，研究表明其神經保護作用與改善大腦缺血區血流量及微循環、抗血小板聚集與血栓形成、抑制細胞凋亡、抗自由基作用等有關[13-15]。LPostC也被證實對腦缺血再灌注損傷具有保護機制，其主要機制包括調節突觸信號、減輕氧化應激和炎癥、維持線粒體完整性、抑制內質網應激、調節自噬、激活PI3K/Akt通路、抑制細胞凋亡、保護神經血管單位等[16]。

目前未見關于LPostC聯合丁苯酞治療缺血性腦卒中的相關研究，聯合應用是否可增強神經保護作用也未見報道。本研究結果表明，丁苯酞和LPostC均可減少MDA含量及增加SOD活性，提示機體減少產生脂質過氧化物且清除氧自由基能力增強，表明氧化應激被抑制；這與前人的研究結果一致。此外，我們還發現LPostC聯合丁苯酞可提高減少MDA產生及SOD活性，強化氧自由基的清除能力，更好的抵抗氧化應激反應。

天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族（Caspases）是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶。腦缺血后線粒體受損導致線粒體膜持續開放，細胞色素C、dATP、凋亡蛋白激活因子-1等形成復合體，激活Caspase-9及下游的Caspase-3，促使細胞凋亡發生[17]。本研究顯示，丁苯酞和LPostC均下調Caspase-3和Caspase-9表達，并且聯合應用可進一步抑制其表達，從而減少細胞凋亡，從而挽救更多的缺血半暗帶組織，減輕缺血再灌注損傷。

綜上所述，肢體缺血后處理或丁苯酞后處理均對腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用，且聯合應用的神經保護效果更好，其機制可能其與抑制氧化應激反應、減少細胞凋亡有關。

PROGRESS

Preliminary Findings of mRNA Covid-19 Vaccine Safety in Pregnant Persons

Tom T Shimabukuro, et al.

Preliminary findings did not show obvious safety signals among pregnant persons who received mRNA Covid-19 vaccines. However, more longitudinal follow-up, including follow-up of large numbers of women vaccinated earlier in pregnancy, is necessary to inform maternal, pregnancy, and infant outcomes.

N Engl J Med. 2021 Apr 21;NEJMoa2104983. doi: 10.1056/NEJMoa2104983.