Vps4b基因敲除鼠上皮根鞘中細胞角蛋白14和增殖細胞核抗原的表達

田晴 王瑩瑩 李強 陳棟

1.鄭州大學第一附屬醫院河南省口腔醫院口腔科，鄭州450052；2.徐州市中心醫院口腔科，徐州221009

遺傳性牙本質發育異常是牙本質礦化及結構異常的一類常染色體顯性遺傳病。不同于以往的Shield 關于牙本質發育異常的分類[1]，目前學者[2]更傾向將其分為牙本質發育不全（dentinogenesis imperfecta，DGI）和根部牙本質發育不良（radic‐ulardentin dysplasia）即牙本質發育不良Ⅰ型（den‐tin dysplasia-Ⅰ，DD-Ⅰ）兩類。DD-Ⅰ是一種牙冠形態大致正常而牙根畸形導致青少年時期牙齒自發脫落的常染色體顯性遺傳病，該病具有遺傳異質性[3]。目前已報道的致病基因有SMOC2、SSUH2 和VPS4B[4-6]。本課題小組在豫北地區發現一個致病基因為VPS4B的DD-Ⅰ家系[6]。

在牙冠即將發育完成時，牙根開始形成。此時在頸環處由內外釉上皮細胞增生形成不含星網狀層和中間層細胞的雙層上皮結構，即上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath，HERS）[7]。HERS是牙根發育的啟動中心，在牙根發育中發揮重要作用[8-9]。其可誘導內側的牙乳頭細胞分化為牙本質細胞，生成根部牙本質。根部牙本質形成時，HERS 發生斷裂，外側的牙囊細胞與牙本質接觸，分化成牙骨質細胞，進而形成根部牙骨質。細胞角蛋白14（cytokeratin 14，CK14）是一種具有很強特異性的牙源性上皮標記蛋白[9]，常用來標記釉質上皮。增殖細胞核抗原（proliferating cell nucle‐ar antigen，PCNA）在DNA 復制中必不可少，可表達于細胞周期的各個階段，通過監測PCNA 細胞核陽性表達的高低可觀察細胞增殖活性強弱[10]。VPS4B 是一種多功能蛋白，可降解溶酶體、轉運胞內蛋白和病毒出芽。HERS的形態、增殖及凋亡對牙根的發育至關重要。本研究擬通過免疫組織化學染色技術來檢測正常小鼠和Vps4b基因敲除小鼠磨牙牙胚中的HERS 形態以及細胞內CK14 和PCNA 的表達情況，進一步探討Vps4b 基因突變對牙根發育異常的可能影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑、設備

野生型C57BL/6J 體系小鼠（濟南朋悅實驗動物繁育有限公司），Vps4b 基因敲除鼠（南京大學-南京生物醫藥研究院）。KAPA 快速DNA 提取試劑盒（北京普凱瑞生物科技有限公司），Taq 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒、寡核苷酸引物（北京鼎國昌盛生物技術有限公司），PCR 擴增儀（Eppendorf 公司，德國），CK14 抗體和PCNA 抗體（北京博奧森生物技術有限公司），光學顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 標本的制備 在同一時刻將基因敲除雄鼠與正常雌鼠以1∶2 的比例交配，新生小鼠出生當天中午計作出生后（postnatal，P）0.5 d，用無菌剪刀剪下2~3 mm 出生后新生小鼠鼠尾，置于1.5 mL離心管，待進行基因型鑒定，剪取時注意避免交叉污染。斷頸法處死出生后5 d（P5 d）、9 d（P9 d）、11 d（P11 d）、15 d（P15 d）以及19 d（P19 d）的新生鼠，使用眼科剪和眼科鑷分離雙側下頜骨組織，4%多聚甲醛溶液固定24 h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液脫鈣3~6 d，梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋，制備5μm的連續切片。

1.2.2 基因型的鑒定 剪碎新生小鼠尾巴，置于1.5 mL 離心管內，提取小鼠基因組DNA（genom‐ic DNA，gDNA）。采用25 μL PCR 反應體系，根據使用說明，待測gDNA 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，引物 1 μL，dNTP 0.5 μL，10×Taq 緩沖液2.5 μL，ddH2O 20 μL 混勻后離心數秒，放入 PCR儀擴增。設計2 種Vps4b gDNA 基因型鑒定引物，見表1。PCR 反應程序：Vps4b-1 進行94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；Vps4b-2進行95 ℃預變性 5 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃30 s， 循 環 20 次 ， 然 后 95 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環 20 次，72 ℃延伸 10 min，16 ℃保存。取擴增產物5 μL，加入瓊脂糖凝膠孔內，觀察電泳結果。

1.2.3 免疫組織化學染色 取P5 d、P9 d、P11 d、P15 d、P19 d新生鼠的雙側下頜骨組織，通過蘇木精-伊紅（hemotoxylin and eosin，HE）染色確定不同時期小鼠下頜第一磨牙牙胚的切片，再使用免疫組織化學法染色。切片脫蠟，乙醇溶液梯度復水，微波爐中蒸煮pH 6.0 的檸檬酸抗原修復液至沸騰后放入切片90 s，PBS 沖洗5 min×3 次；在切片組織上避光滴加3%H2O2，靜置30 min，蓋上蓋子，PBS 沖洗5 min×3 次；滴加適量10%兔血清，室溫封閉1 h；分別滴加1∶100 稀釋的CK，1∶200 稀釋的PCNA，封盒，4 ℃冰箱內過夜保存；PBS沖洗5 min×2次，滴加二抗，37 ℃濕盒內靜置30 min；PBS 沖洗 5 min×2 次，滴加辣根過氧化物酶，37 ℃下放置30 min；滴加DAB 顯色，蘇木素復染，乙醇溶液脫水，二甲苯溶液（Ⅰ）、二甲苯溶液（Ⅱ）中透明，滴加中性樹膠封固，觀察切片并拍照。

1.2.4 免疫組織化學結果判定 在100 倍下觀察染色情況，顏色明顯高于背景的記為強陽性，高于背景的記為陽性，略高于背景的記為弱陽性，CK14 陽性物質位于細胞質內，PCNA 陽性物質位于細胞核內。CK14 胞質棕紅色為陽性表達，藍色為陰性表達；PCNA胞核棕褐色或棕黃色為陽性表達，藍色為陰性表達。

2 結果

2.1 小鼠基因型鑒定結果

PCR 結果顯示，F1/R1 作為引物，擴增出2 種條帶，一種1 383 bp 條帶，一種384 bp 條帶（圖1左）；F2/R2 作為引物，擴增出一種425 bp 條帶（圖1右）。這表明，新生小鼠中存在雜合型和野生型，不存在純合突變型。

圖 1 小鼠Vps4b gDNA擴增Fig 1 Amplification of Vps4b gDNA

2.2 不同發育時期HERS形態

CK14 抗體免疫組織化學可以觀察到：正常小鼠P5 d 開始形成HERS，并向未來根尖方向生長；P9 d 開始出現根分叉結構，此時HERS 結構連續，外層為矩形細胞，內層為立方狀細胞；到P11 d，一小部分HERS 結構開始發生斷裂，HERS 細胞在牙根面呈簇狀聚集；在P15 d，HERS 結構斷裂，僅末端部分完整，此時牙根的1/3 已形成；P19 d牙根基本達到生理性發育的長度，HERS末端結構仍完整，斷裂HERS 細胞緊貼牙根面（圖2 上）。Vps4b 基因敲除小鼠同樣于P5 d 形成HERS 結構；然而在P9 d，HERS 就開始斷裂；在P11 d 到P15 d根尖HERS 結構完整，頸部呈不規則細胞簇；在P19 d 牙根表面僅存少量HERS 碎片，且根尖的發育不成熟（圖2下）。

2.3 PCNA的表達分布

PCNA 免疫組織化學結果見圖3。P5 d，PC‐NA 在正常小鼠頸部冠邊緣附近的成釉細胞和HERS細胞中強陽性表達，牙囊細胞和牙乳頭細胞中陽性表達；在Vps4b 基因敲除小鼠成釉細胞、HERS細胞、牙囊細胞及牙乳頭細胞陽性表達，但強度降低。P9 d，PCNA 在正常小鼠牙乳頭細胞中呈強陽性表達，成釉細胞、HERS細胞和牙囊細胞中陽性表達；在Vps4b基因敲除小鼠牙乳頭細胞呈陽性表達，成釉細胞、HERS 細胞弱陽性表達。P11 d，PCNA 在正常小鼠牙乳頭細胞呈陽性表達，成釉細胞、HERS 細胞和牙囊細胞中弱陽性表達；在Vps4b基因敲除小鼠牙根表面HERS 細胞中弱陽性表達，在牙乳頭細胞中呈弱陽性表達。P15 d，PCNA在正常小鼠牙乳頭細胞陽性表達，牙囊細胞弱陽性表達，牙根表面HERS 細胞中弱陽性表達；在Vps4b基因敲除小鼠牙囊細胞及牙乳頭細胞陽性表達，HERS細胞中弱陽性表達。P19 d，PCNA僅在正常小鼠牙根末端HERS細胞中陽性表達、牙乳頭細胞和牙囊細胞中弱陽性表達；在Vps4b基因敲除小鼠HERS細胞弱陽性表達，牙囊細胞及牙乳頭細胞中無表達。

圖 2 CK14免疫組織化學結果 ×100Fig 2 Immunohistochemical results of cytokeratin 14 ×100

圖 3 PCNA免疫組織化學結果 ×100Fig 3 Immunohistochemical results of PCNA ×100

3 討論

條件性基因敲除技術是研究基因的一種重要方法。本研究中的Vps4b 基因敲除小鼠是通過CRISPR-Cas9技術獲得的[11]，均為雜合子，理論上子代小鼠有Vps4b+/+、Vps4b+/-、Vps4b-/-3 種類型。本研究中PCR 擴增顯示子代小鼠中不存在Vps4b-/-純合子，說明Vps4b基因在胚胎發育過程中起重要作用，且已有研究[12]表明Vps4b基因敲除小鼠純合突變在胚胎早期發育階段致死。VPS4B 基因通過Wnt-β-catenin 信號通路調節人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的增殖、遷移和向成牙本質細胞分化，在hDPSCs向成牙本質細胞分化過程中存在高度表達的VPS4B 蛋白。這表明Vps4b基因在牙齒發育中發揮重要作用。

正常牙根的發育與HERS密切相關，首先需要形成完整的HERS，繼而HERS 在特定的時期斷裂，同時HERS細胞發生凋亡。本實驗中正常小鼠P11 d HERS 開始發生斷裂，而Vps4b 基因敲除小鼠HERS 在P9 d 就開始斷裂，最終牙根發育不完整，提示Vps4b 基因對牙根的發育有一定的影響。本研究利用PCNA 監測HERS細胞及其周圍細胞的增殖活性，發現 P5 d 到 P19 d，PCNA 在 HERS 末端始終陽性表達，表明HERS細胞增殖在牙根生長發育中的潛在重要作用。與正常小鼠相比，Vps4b基因敲除小鼠P9 d 時HERS 結構就開始斷裂，PC‐NA 在HERS 細胞、牙乳頭細胞中的表達強度顯著降低，P19 d 時PCNA 僅在HERS 細胞中弱陽性表達，因此本研究推測Vps4b 基因可能通過降低HERS 細胞及牙乳頭細胞的增殖活性，影響HERS斷裂的時間以及成牙本質細胞的形成，進而導致牙本質形成異常。

本研究通過免疫組織化學方法，觀察到不同時期HERS 的形態變化以及PCNA 在Vps4b 基因敲除小鼠HERS中的表達改變，進一步推測Vps4b 基因突變導致HERS細胞增殖發生改變，最終引起牙根發育異常。VPS4B 基因可通過MAPK 通路調控細胞的數量變化[13]，本研究猜測Vps4b基因可能也通過MAPK通路調控HERS細胞的增殖凋亡。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。