二陳湯對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織IRS-1／IRS-2的調(diào)節(jié)作用

陳錦明，王維斌，張 萍，黃 娜，鄧 姣，俞 潔*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122；2.麗水市第二人民醫(yī)院，浙江 麗水323000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病之一，與女性不孕不育有密切聯(lián)系。據(jù)報(bào)道，臨床約有50%～70%的PCOS患者存在胰島素抵抗（insulin resistance，IR）現(xiàn)象［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢組織中存在能夠介導(dǎo)胰島素作用的所有信號(hào)蛋白和代謝酶，且PCOS患者卵巢組織中出現(xiàn)IR現(xiàn)象，當(dāng)前研究認(rèn)為其分子機(jī)制主要與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路環(huán)節(jié)異常相關(guān)［2］。在西醫(yī)藥物治療方面，主要應(yīng)用二甲雙胍等胰島素增敏藥物。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用化痰法能夠有效改善PCOS合并IR患者的臨床癥狀，提高臨床治療的總有效率，且安全性較應(yīng)用二甲雙胍高［3］。而針對(duì)化痰法改善PCOS卵巢組織IR現(xiàn)象的作用途徑卻少有報(bào)道。因此，為進(jìn)一步探討化痰法改善卵巢組織IR的生物學(xué)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了化痰法對(duì)PCOS模型大鼠卵巢組織胰島素受體（insulin receptor，INSR）底物IRS-1和IRS-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響，為PCOS的臨床治療提供部分參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 21日齡SPF級(jí)SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量（50±10）g，均購于上海斯萊克動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SYXK（閩）2014-0001，動(dòng)物合格證編號(hào)：2015000540932。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障系統(tǒng)，許可證編號(hào)：SYXK（閩）2014-0001，飼養(yǎng)環(huán)境溫度及濕度恒定，溫度（20±2）℃，濕度40%～60%，12 h周期性光照環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)已通過福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：H20023370）。二陳湯藥物組成：陳皮15g，姜半夏15g，茯苓9g，炙甘草4.5g，委托福建省第三人民醫(yī)院制備，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 脫氫表雄酮（DHEA，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10098326）；逆轉(zhuǎn)錄和SYBR試劑盒（日本TAKARA公司，批號(hào)AI21033A、AI12394A）；注射用大豆油劑（江西益普生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20160602）；羊抗兔二抗（英國(guó)MDL公司，批號(hào)：MD2141）；兔抗胰島素受體底物（IRS）-1一抗，兔抗IRS-2一抗，兔抗β-actin一抗（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab53167、ab134101、ab8227）；蘇木素-伊紅染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20180727）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 QuantStudio6 Flex型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；ChemiDoxTMXRS＋型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀、170-3940型半干轉(zhuǎn)印槽、170-3930型垂直電泳系統(tǒng)、170-4070型轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；SHP-250型生化箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）；Nandrop2000型超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模與分組 采用DHEA誘導(dǎo)PCOS模型大鼠［4］。將40只21日齡SPF級(jí)SD雌性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，按體質(zhì)量由大到小的順序依次編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組12只和造模組28只。造模組大鼠每日于頸背部皮下注射DHEA［6mg／（100 g·d）＋0.2mL注射用大豆油］，正常組每日頸背部皮下注射0.2mL的注射用大豆油，連續(xù)注射20 d。造模結(jié)束后，將成模大鼠按體質(zhì)量從大到小依次編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、二陳湯組、二甲雙胍組各8只。二陳湯組按4.35 g／（kg·d）予二陳湯灌胃，二甲雙胍組按0.158mg／（kg·d）予二甲雙胍灌胃，模型組及正常組給予等體積滅菌飲用水灌胃，分別干預(yù)4周后取材。實(shí)驗(yàn)期間均采用普通飼料喂養(yǎng)。

2.2 ELISA法檢測(cè)大鼠血清指標(biāo) 根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各樣本OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算出血清雄激素（T）和胰島素（INS）水平濃度。

2.3 Real-time PCR檢測(cè)大鼠卵巢組織IRS-1和IRS-2 mRNA表達(dá) 將卵巢組織勻漿后，用TRI zol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，IRS-1（143 bp）：上游5"-CYGCACTCACCCTAG ACCCA-3"，下游5"-TGACTCCGAAATTCACGCCG-3"；β-actin（136 bp）：上游5"-CTCTGTGTGGATTGGTG GCT-3"，下游5"-AGCTCAGTAACAGTCCGCC T-3"；IRS-2（197 bp）：上 游5"-GCATGTTTCCAACCAAC GCT-3"，下游5"-GAGTGTACTCCATCAGCCCT-3"。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火31 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用相對(duì)定量分析法進(jìn)行分析。

2.4 Western blot檢測(cè)大鼠卵巢組織IRS-1和IRS-2蛋白表達(dá) 從大鼠卵巢組織中提取總蛋白，運(yùn)用BCA蛋白定量法測(cè)定所提取的蛋白濃度，根據(jù)不同蛋白分子量分離相應(yīng)膠帶，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。抗體稀釋比例：IRS-1、IRS-2一抗（1∶1500），β-actin一抗（1∶5000）；IRS-1、IRS-2、β-actin二抗（1∶2000）。ECL發(fā)光檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；若方差齊性，采用LSD方法分析；若方差不齊，選擇Dunnett T3方法進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 4組大鼠血清T、INS濃度比較 見表1。

表1 4組大鼠血清T、INS濃度比較（±s）

表1 4組大鼠血清T、INS濃度比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

INS／（mU／L）0.41±0.050.49±0.050.42±0.140.38±0.06組別正常組模型組二甲雙胍組二陳湯組n 8888 T／（nmol／L）0.37±0.112.96±1.231）0.43±0.162）0.42±0.152）

3.2 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2 mRNA水平比較 見表2。

表2 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2 mRNA水平比較（±s）

表2 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2 mRNA水平比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

IRS-21.06±0.460.20±0.051）0.75±0.072）0.81±0.192）組別正常組模型組二甲雙胍組二陳湯組n 8888 IRS-11.07±0.340.63±0.151）1.02±0.242）0.91±0.283）

3.3 4組大鼠卵巢組織IRS-1和IRS-2蛋白表達(dá)比較 見表3、圖1。

圖1 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2蛋白電泳圖

表3 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 4組大鼠卵巢組織IRS-1、IRS-2蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

IRS-20.51±0.050.27±0.021）0.41±0.022）0.50±0.022）組別正常組模型組二甲雙胍組二陳湯組n 8888 IRS-10.58±0.060.28±0.061）0.41±0.070.57±0.072）

4 討論

IR是PCOS重要的病理生理基礎(chǔ)，IRS-1和IRS-2作為胰島素受體后信號(hào)傳導(dǎo)的主要船塢蛋白，與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系最為密切［5］。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的卵泡膜細(xì)胞中IRS-1及IRS-2表達(dá)水平明顯升高［6］，而PCOS-IR僅表現(xiàn)出胰島素代謝功能異常，其甾體激素分泌功能未受影響，IRS-1及IRS-2的表達(dá)水平升高會(huì)促使卵泡膜細(xì)胞分泌過量的雄激素，導(dǎo)致卵巢局部高雄激素血癥的發(fā)生［7-8］。因此，臨床中常應(yīng)用胰島素增敏劑，促使PCOS患者的胰島素敏感性增強(qiáng)，改善胰島素抵抗，同時(shí)有效降低雄激素水平［9］，從而降低卵泡發(fā)育異常及排卵障礙。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清T水平明顯升高，血清INS水平也出現(xiàn)升高趨勢(shì)，卵巢組織中IRS-1、IRS-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降，說明模型組大鼠出現(xiàn)高雄激素血癥且卵巢組織中出現(xiàn)胰島素信號(hào)通路環(huán)節(jié)異常，這將提高卵巢組織局部的高雄激素血癥及胰島素抵抗發(fā)生的可能，從而導(dǎo)致卵泡的發(fā)育與排卵受到影響。

在PCOS中醫(yī)證型分布中，痰濕證的占據(jù)比例高［10］。張紅陽等［11］通過研究不同穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的PCOS患者中醫(yī)體質(zhì)分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同HOMA-IR組中痰濕質(zhì)所占比均較高，提示“痰濕”與IR之間存在一定關(guān)系。郝松莉等［12］進(jìn)一步對(duì)比分析痰濕型與非痰濕型PCOS患者的臨床生化特征，發(fā)現(xiàn)痰濕型PCOS患者較非痰濕型存在更為明顯的糖脂代謝以及胰島素異常。本研究以化痰法經(jīng)典代表方劑二陳湯作為干預(yù)手段，探討化痰法對(duì)PCOS大鼠卵巢組織胰島素受體底物表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與模型組比較，二陳湯組IRS-1、IRS-2 mRNA及蛋白水平均明顯升高，提示二陳湯可能通過改善卵巢組織中蛋白受損狀態(tài)，調(diào)節(jié)卵泡的胰島素受體信號(hào)傳導(dǎo)通路，提高對(duì)胰島素的敏感性，使胰島素與受體結(jié)合的能力恢復(fù)；同時(shí)血清T水平明顯降低，提示二陳湯可改善卵巢局部激素環(huán)境，其作用機(jī)制是否同胰島素增敏劑調(diào)控卵巢組織糖代謝的同時(shí)影響卵巢的內(nèi)分泌功能，還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，二陳湯化痰法可以降低PCOS模型大鼠血清T水平，使卵巢局部微環(huán)境得到改善，促進(jìn)卵巢組織中胰島素受體底物IRS-1、IRS-2 mRNA及蛋白水平的表達(dá)上調(diào)，從而提高卵巢組織對(duì)胰島素的敏感性，加強(qiáng)對(duì)胰島素的利用，進(jìn)而改善卵泡IR狀態(tài)。