基于TLR4／NF-κB信號通路研究甘草瀉心湯治療潰瘍性結腸炎大鼠的機制

張建偉，陳橋英，陳 儀

（福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州350122）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種原因不明的慢性炎癥性腸道疾病，隨著社會快速發展、生活方式及飲食結構的改變，在我國的發病率逐年上升，發病率最低估算約為11.60／10000［1］。研究發現TLR4／NF-κB是潰瘍性結腸炎的重要信號通路之一，TLR4與炎癥和免疫息息相關，NF-κB作為TLR4信號通路下游重要的多功能核轉錄因子，激活后在機體的炎癥、免疫反應、細胞凋亡等過程中起樞紐作用。因此本文旨在通過對TLR4／NF-κB炎癥通路的深入研究，探討甘草瀉心湯對UC的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級Wistar雄性大鼠42只，體質量200 g左右，鼠齡8周，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，飼養在福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室。

1.2 實驗藥物 甘草瀉心湯［2］按原方比例：生甘草12g，半夏9g，干姜9g，黃芩9g，黃連3g，人參9g，大棗6g，購于福建中醫藥大學附屬第三人民醫院。柳氮磺吡啶腸溶片（上海福達制藥有限公司）。

1.3 實驗試劑 2，4-二硝基氯苯、水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇、丙酮、冰乙酸（西隴化工股份有限公司）；過氧化氫（國藥集團化學試劑有限公司）；液體石蠟、蘇木素伊紅（北京索萊寶科技有限公司）；硫化鈉（天津恒興化試劑發展有限公司）；無菌PBS緩沖液（美國HyClone公司）；生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司）；白介素-6（IL-6）、IL-8 ELISA試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）；IL-10 ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；NF-κB p65（Ab-536）Antibody、TLR4 Antibody（美國Signalway Antibody）。

1.4 實驗儀器 RM2135切片機、LeicaDM400B顯微圖像采集系統、生物顯微鏡（德國Leica公司）；64R型低溫高速離心機（美國BECKMAN公司）；TB-718E生物組織自動包埋機（湖北泰維醫療科技實業有限公司）；ZT-12JI生物組織自動脫水機、YT-7FB生物組織攤烤片機（亞光醫用電子技術研究所）；ELx800全自動酶標儀（美國BioTek公司）。

2 方法

2.1 分組與造模 42只Wistar大鼠適應性飼養1周后隨機分為空白組、模型組、西藥組、甘草瀉心湯低劑量組（低劑量組）、甘草瀉心湯中劑量組（中劑量組）、甘草瀉心湯高劑量組（高劑量組），每組各7只。除空白組外，其他各組參照江學良復合法并稍加改進［3］，用2，4-二硝基氯苯和醋酸復合法建立大鼠UC模型。操作：頸背部用6%Na2S脫毛，每日用2%的2，4-二硝基氯苯丙酮液滴背1次，每次0.3mL，連續14 d。第15天用潤滑后直徑約3mm的尼龍導管經肛門插入結腸約8cm處，注入0.04mmol／L（0.1%）的2，4-二硝基氯苯乙醇液（50%）0.25mL，第16天注入8%醋酸溶液2mL，精確定時15 s后，用5mL生理鹽水沖洗。造模完成后常規飲食，不予任何干預，觀察2 d。空白組造模前后均常規飲食，不給予任何干預。

2.2 干預 造模后第3天開始給藥，連續14 d，各治療組均以相應藥物灌胃。按照《中藥藥理研究方法學》［4］計算，成人體質量按60 kg估算，成人向大鼠的用藥換算系數為6.17。低、中、高劑量組分別按2.93、5.86、11.72 g／（kg·d）予甘草瀉心湯藥液灌胃；西藥組按0.31 g／（kg·d）予柳氮磺吡啶藥液灌胃；空白組不予干預，自由飲食；模型組予同等體積蒸餾水灌胃。各組每日灌胃1次，連續干預14 d。

2.3 取材 灌藥觀察14 d后，禁食24 h取材，所有大鼠進行腹主動脈取血，分離血清，-20℃低溫冰箱保存。取距肛緣8cm處的結腸，沿縱軸剖開觀察，剪取病變嚴重處黏膜組織，生理鹽水沖洗干凈，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 結腸組織HE染色 結腸組織蠟塊，常規切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織形態，拍片留取。

2.4.2 檢測指標 采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法測定血清炎IL-6、IL-8、IL-10表達水平。免疫組化法分析檢測結腸黏膜組織TLR4、NF-κB p65的表達，具體方法和步驟嚴格按試劑盒說明書操作。

2.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學處理，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 實驗完成情況 模型組大鼠因藥物反應死亡1只，高劑量組大鼠因灌胃手法不當，戳穿氣管，死亡1只。

3.2 對結腸組織病理形態學的影響 空白組黏膜上皮結構完好、清晰，細胞排列均勻，無明顯炎癥細胞浸潤。模型組黏膜上皮壞死脫落嚴重，局部糜爛、潰瘍，固有層內腺體結構嚴重破壞，間質充血水腫明顯，多數結腸黏膜下層可見大片彌漫性炎癥細胞浸潤。各治療組病變均較模型組有所減輕，尤其是高劑量組、西藥組與模型組比較，黏膜各層結構更為清晰，黏膜上皮的潰瘍或糜爛，間質的充血水腫及下層的炎癥細胞浸潤都有不同程度的好轉。見圖1。

圖1 6組大鼠結腸組織HE染色病理圖（×200）

3.3 6組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10表達水平比較 見表1。

表1 6組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10表達水平比較（±s）pg／mL

表1 6組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10表達水平比較（±s）pg／mL

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與中劑量組比較，3）P＜0.05。

組別空白組模型組西藥組低劑量組中劑量組高劑量組n 767776 IL-68.32±3.5226.86±4.281）3.72±2.991）2）3）5.36±2.652）3）12.85±3.811）2）2.67±0.491）2）3）IL-8119.92±11.45153.92±16.361）99.71±12.181）2）3）123.92±15.782）123.92±6.172）119.03±18.422）IL-1013.38±4.157.71±3.051）7.66±0.671）3）11.44±3.143）17.97±4.831）2）12.28±2.072）3）

3.4 6組大鼠結腸組織TLR4、NF-κB p65表達比較 見表2。

表2 6組大鼠結腸組織TLR4、NF-κB p65表達比較（±s）

表2 6組大鼠結腸組織TLR4、NF-κB p65表達比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.01。

組別空白組模型組西藥組低劑量組中劑量組高劑量組TLR40.137±0.0180.534±0.0251）0.271±0.0291）3）0.268±0.0411）3）0.228±0.0311）3）0.217±0.0633）NF-κB p650.086±0.0160.464±0.061）0.154±0.011）3）0.231±0.0461）3）0.156±0.0161）3）0.127±0.0172）3）

4 討論

潰瘍性結腸炎是一種慢性炎癥性疾病，雖然其發病機制尚不清楚，可能與遺傳因素以及免疫功能失調密切相關［5］。隨著對免疫系統越來越多的深入研究，發現TLRs家族中的TLR4介導的信號轉導通路是UC發病過程中的重要環節，NF-κB作為TLR4信號通路下游重要的多功能核轉錄因子，激活后在機體的炎癥、免疫反應、細胞凋亡等過程中起樞紐作用［6-7］。活化的NF-κB可促進IL-6、IL-8等炎癥細胞因子大量分泌。這些細胞因子又進一步激活NF-κB，形成正反饋調節，使炎癥反應放大［8］。因此調節TLR4／NF-κB信號通路可能是治療UC的主要靶點［9］。

多數醫家認為UC屬于中醫“痢疾”“泄瀉”等疾病范疇，脾胃虛弱、濕熱內蘊，寒熱錯雜、虛實夾雜是其主要病機。甘草瀉心湯出自《金匱要略》，由半夏瀉心湯重用生甘草化裁而來，方中重用生甘草為君取其清熱解毒；黃芩、黃連協助生甘草瀉火，燥濕清熱；半夏、干姜溫中健脾燥濕；人參、大棗補中益氣。全方辛開苦降，寒溫并用，升清降濁，既使中州得健以扶正，又清熱祛濕以祛邪。現代藥理研究證明，甘草瀉心湯保護消化道黏膜的機制可能是通過調理腸道菌群、抑制炎性信號通路、修復黏膜細胞等作用，從而達到防治消化道黏膜炎癥的目的［10］。實驗研究發現甘草瀉心湯聯合西藥具有修復UC患者腸黏膜屏障，改善腸黏膜通透性，恢復腸道菌群多樣性等方面的作用［11-12］。

本課題實驗結果顯示，甘草瀉心湯能明顯改善UC大鼠結腸組織的病理學炎性改變，降低TLR4、NF-κB p65蛋白表達，抑制血清促炎性因子IL-6、IL-8水平，進而上調抗炎細胞因子IL-10水平，表明甘草瀉心湯可通過對TLR4／NF-κB炎癥信號通路的調節而發揮對UC的治療作用。其機制可能是通過抑制TLR4活性，以阻止其下游的核轉錄因子NF-κB的激活，阻礙其信號傳遞，降低促炎性因子IL-6、IL-8的產生，進而上調抗炎細胞因子IL-10的水平，減少炎癥反應，表明甘草瀉心湯具備一定程度的抗炎、抗潰瘍、保護黏膜、改善水腫充血等作用，從而改善腸道功能，其中甘草瀉心湯高劑量組的療效及各種調節作用較為顯著。