NEDD4在食管鱗癌中的表達及作用研究

鄭珺文，常 晨，郝佳潔，蔡 巖，王明榮，張 鈺

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021)

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國高發的消化道惡性腫瘤，其發病率和死亡率分別位居我國惡性腫瘤的第4和第5位。目前，ESCC發病的分子機制尚未完全闡明，在其發生發展過程中發揮關鍵作用的分子及其作用機制仍有待深入研究。

神經前體細胞表達發育下調蛋白4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4，NEDD4)為含HECT結構域的E3連接酶家族中的NEDD4亞家族成員。NEDD4在哺乳類動物的組織中廣泛表達，可介導底物蛋白泛素化和蛋白酶體降解過程，受體介導的內吞作用，以及蛋白的運輸[3-4]。

NEDD4是一個在進化中高度保守的蛋白。人NEDD4位于15q21.3，含30個外顯子，編碼約120 kD的蛋白。有研究顯示NEDD4在胃癌、結直腸癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、子宮內膜癌和乳腺癌等多種人類惡性腫瘤中過表達，與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關，并與胃癌、肝癌及乳腺癌患者的不良預后顯著相關。同時，有研究顯示NEDD4參與調節細胞增殖、凋亡、侵襲運動、上皮-間葉細胞轉化和藥物抗性等過程，從而在腫瘤發生發展中發揮重要作用。

既往文獻報道NEDD4過表達與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關，但其在ESCC中的表達改變尚無文獻報道。本研究檢測分析了ESCC組織中NEDD4的表達變化，發現NEDD4的蛋白和mRNA均存在表達上調現象，進而分析了NEDD4過表達與ESCC臨床病理指標的關系，并檢測了其過表達對ESCC細胞增殖能力的影響。本研究結果為闡明食管癌變的分子機制提供了實驗依據，并且為食管鱗癌的靶向治療提供了新的潛在分子靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養基為Cell Technology公司產品。NEDD4抗體購于Millipore，ERK抗體購于Cell Signaling Technology。Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，siRNA序列由上海吉瑪公司合成，qPCR引物序列由北京天一輝遠公司合成。組織&細胞RNA純化試劑盒與HiFiScript cDNA合成試劑盒均購于康為世紀公司。TB GreenPremix Ex Taq試劑盒購于TaKaRa公司。CCK8檢測試劑盒購于Dojindo公司。ABI QuantStudio實時定量PCR儀由ABI公司生產，微版分光光度計ELX808購于美國BioTek Instruments公司。

1.2 組織樣品及組織芯片制備

本研究中使用的131例ESCC組織及同一患者手術切端形態正常的組織，均取自2007—2011年中國醫學科學院腫瘤醫院臨床診斷后的剩余標本。所有組織標本均為無壞死的新鮮組織，按照常規方法使用福爾馬林固定及石蠟包埋，并按文獻方法構建包含ESCC和鄰近正常上皮細胞的組織微陣列。其中，每個病例包含3個代表性的癌組織和2個手術切緣正常組織點。本研究由中國醫學科學院腫瘤醫院倫理委員會批準實施(No.16-084/1163)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.3 免疫組織化學分析及結果評價

免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色按常規方法進行，抗NEDD4抗體購自Millipore公司。根據染色強度和染色的面積評價NEDD4蛋白的染色結果，并由兩名研究者分別進行評估。其中，染色強度評分為：陰性0分；弱陽性1分；中等陽性2分；強陽性3分。染色面積評分為：≤10%為0分；＞10%～25%為1分；＞25%～50%為2分；＞50%～75%為3分；＞75%為4分。將染色強度與染色面積評分的乘積作為NEDD4蛋白表達的最終評分，并由此將NEDD4的表達水平分為弱表達(≤8分)和強表達(＞8分)兩類。

1.4 Western blot檢測

6對配對的ESCC和手術切緣正常食管上皮組織的總蛋白提取及SDS-PAGE按照常規方法進行。蛋白裂解物經SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，與抗NEDD4抗體和抗ERK抗體雜交，使用超敏化學發光檢測試劑顯示雜交信號。

1.5 ESCC、正常食管上皮組織及ESCC細胞系mRNA表達數據獲取

從UCSC-Xena網站(https://xena.ucsc.edu/)下載TCGA數據庫中ESCC組織mRNA表達數據和相關病例信息，從GTEx網站(https://gtexportal.org/home/datasets)下載正常食管上皮組織的mRNA表達數據(GTEx Analysis-v8)和相關樣本信息。將mRNA表達譜與對應的臨床數據或樣本信息數據進行匹配篩選，得到含有臨床信息的82例ESCC及555例正常食管上皮組織的mRNA表達數據。為比對食管鱗癌組織與正常食管上皮組織中NEDD4表達水平的差異，將TCGA和GTEx數據庫中NEDD4的mRNA表達數據進行轉換處理，使其單位統一，消除批次效應后進行mRNA表達水平的差異分析。從CCLE數據庫(https://portals.broadinstitute.org)下載ESCC細胞系NEDD4 mRNA的表達數據。

1.6 細胞培養

人ESCC細胞系KYSE30和KYSE150由日本京都大學Y.Shimada教授惠贈，均經過短串聯重復序列基因分型鑒定。細胞在含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100μg/mL)的RPMI 1640培養基中培養，在37℃、CO體積分數為5%的孵箱中培養。

1.7 siRNA轉染

在KYSE30及KYSE150細胞中，使用Lipofectamine 2000轉染NEDD4特異性siRNA或陰性對照siRNA，按產品說明書進行操作。NEDD4特異siRNA靶 序 列 為：T1：5′-TGGCGATTTGTAAACCGAA-3′，T2：5′-TACGTGAGAGTGACGTTATAT-3′，陰性對照siRNA靶序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.8 RNA分離和實時定量PCR(qPCR)

采用組織&細胞RNA純化試劑盒提取純化細胞總RNA。將得到的RNA作為模板，使用HiFiScript cDNA合成試劑盒逆轉錄合成cDNA。使用TB GreenPremix Ex Taq試劑盒及ABI QuantStudio實時定量PCR儀進行qPCR實驗。以GAPDH的mRNA表達水平為內參照，進行歸一化處理，獲得靶基因的相對mRNA表達水平。相關引物由天一輝遠公司合成，序列如下：NEDD4正向引物，5′-CCACCAGGTTGGG AAGAAAAA-3′；NEDD4反向引物，5′-TCCAAGTA GTCGTTCTGGAATTG-3′。GAPDH正 向 引 物，5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3；GAPDH反向引物，5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。

1.9 細胞增殖活力檢測

實驗分為3組，分別是陰性對照siRNA、NEDD4-siRNA-T1及NEDD4-siRNA-T2轉染組。在96孔板中接種1 000個細胞，每組設3個復孔。細胞貼壁后，每24 h使用CCK8試劑盒檢測細胞增殖活力，按試劑盒說明書進行操作。使用微板分光光度計ELX808在450 nm處測定吸光度值

D

(450)，并按以下公式計算細胞的增殖率和增殖抑制率：

1.10 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。使用Pearson卡方檢驗及Fisher精確檢驗分析NEDD4蛋白表達水平與臨床病理指標之間的相關性。使用one-way ANOVA檢驗分析NEDD4敲降細胞中NEDD4 mRNA水平的變化情況及細胞增殖活力的變化，組間比較采用LSD檢驗。

P

＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NEDD4在ESCC組織中過表達

本研究首先使用IHC染色技術在131例配對的ESCC組織中檢測了NEDD4蛋白的表達情況。IHC分析結果顯示，NEDD4在40%(53/131)的ESCC組織中呈高水平表達，在手術切緣正常食管上皮組織中不表達或低水平表達。同時，IHC染色結果顯示ESCC組織中NEDD4蛋白主要定位于細胞質(圖1A)。進而，我們對NEDD4蛋白表達與ESCC臨床病理指標的關系進行了分析，統計分析結果顯示NEDD4蛋白的表達與腫瘤浸潤深度和分化程度顯著相關(均為

P

＜0.05，表1)。

表1 食管鱗癌組織中NEDD4蛋白表達水平與臨床病理指標的關系

同時，本研究對6對配對的ESCC和手術切緣正常食管上皮組織中NEDD4蛋白的表達水平進行了Western blot檢測，結果顯示NEDD4蛋白在4例ESCC樣本中表達明顯上調(圖1B)。繼而，我們使用TCGA和GTEx數據庫中的mRNA表達數據，對ESCC和正常食管上皮組織中NEDD4的mRNA表達水平進行了分析，結果顯示ESCC組織中NEDD4的mRNA表達水平顯著高于正常食管上皮組織(

P

＜0.01，圖1C)。

2.2 NEDD4過表達促進ESCC細胞的增殖能力

為進一步揭示NEDD4高表達對ESCC細胞惡性表型的影響，本研究對NEDD4的功能進行了初步研究。首先，我們使用CCLE數據庫中的mRNA表達數據，對10株ESCC細胞系中NEDD4 mRNA的表達水平進行了對比。分析結果顯示，ESCC細胞系KYSE520、KYSE70、KYSE30和KYSE150中NEDD4 mRNA的表達水平相對較高(圖2A)。

圖1 NEDD4蛋白在ESCC組織中過表達

在此基礎上，我們在NEDD4高表達的ESCC細胞系KYSE30和KYSE150中瞬時轉染2個靶向NEDD4的siRNA。qPCR檢測結果顯示，靶點1和靶點2可分別使KYSE30細胞中NEDD4 mRNA的表達水平下調84.2%和87.8%，使KYSE150細胞中NEDD4 mRNA的表達水平下調78.7%和84.7%(

P

＜0.01，圖2B)，表明這2個獨立的siRNA靶點均可有效抑制KYSE30和KYSE150細胞中NEDD4 mRNA的表達。繼而，CCK8細胞增殖活力分析結果顯示，細胞接種后第6天，兩個轉染NEDD4 siRNA的實驗組細胞增殖活力顯著低于轉染陰性對照siRNA的對照組細胞(均為

P

＜0.01，圖2C)。靶點1和靶點2對KYSE30細胞增殖的抑制率分別為93.5%和93.8%，對KYSE150細胞增殖的抑制率分別為77.4%和99.7%(圖2D)，表明敲降NEDD4的表達可以顯著抑制KYSE30和KYSE150細胞在體外的增殖活力。

圖2 敲降NEDD4表達抑制ESCC細胞的增殖活力

3 討論

E3連接酶NEDD4在多種惡性腫瘤中存在異常表達并可發揮促癌作用，但其在ESCC中的表達狀態和功能作用尚無文獻報道。在本研究中，我們發現ESCC組織中存在NEDD4 mRNA和蛋白水平的表達上調。同時，本研究結果提示NEDD4過表達可促進ESCC細胞的增殖。

首先，本研究通過IHC染色分析發現，NEDD4蛋白在ESCC組織中表達上調，而且其表達水平與腫瘤分化程度和浸潤深度顯著正相關。Western blot檢測結果也證實ESCC組織中存在NEDD4蛋白的過表達。同時，對TCGA和GTEx數據庫中相關數據進行分析的結果表明，NEDD4 mRNA的表達水平在ESCC組織樣品中也存在顯著上調。以往文獻報道NEDD4表達或活性可受多種上游因子或信號通路的調控，例如PTENPI3K/Akt、RAS、c-Src、Numb、FoxM1B、PKCδ、p34SEI-1、YOD1、miR-30、miR-1和Hsa-miR-199a-3p等。目前，NEDD4在ESCC中表達上調的分子機制還有待闡明。

同時，既往研究顯示，NEDD4過表達可促進胃癌、結直腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖、運動和侵襲能力，在惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用，并且被認為是一個很有希望的腫瘤治療靶點。本研究結果顯示，NEDD4過表達可顯著增強ESCC細胞的增殖活力，但其作用的詳細分子機制目前尚不清楚。一些報道顯示，NEDD4通過對各種底物蛋白進行泛素化修飾調控它們在細胞中的豐度，從而在腫瘤發生過程中發揮重要作用。目前已知的NEDD4底物蛋白包括PETN、RAS、LATS1、EGFR和Notch等，但ESCC細胞中受NEDD4調控的關鍵底物還有待于深入研究。

綜上所述，本研究結果初步提示NEDD4異常過表達在ESCC的發生發展中可能發揮促癌作用。目前，NEDD4過表達對ESCC細胞惡性表型的影響及其作用的分子機制尚不清楚，后續研究將對此進行深入探討，揭示其在ESCC發生發展中的作用并探討其作為ESCC治療靶點的潛在應用價值。