環狀RNA在食管癌中的研究進展

張玉領，陳 培

(江蘇護理職業學院，江蘇 淮安 223005)

中國國家癌癥中心統計數據顯示，2015年中國新發癌癥429.2萬例，癌癥死亡281.4萬例，在導致中國人群死亡排名前5位的腫瘤中食管癌位居第4位。盡管食管癌相關診療手段不斷進步，但由于食管癌惡性程度高，預后較差，5年生存率僅為15%～34%。為改善治療，提高生存率，需要尋找新的影響食管癌發生發展的生物標志物和治療靶點，為臨床診療提供依據。

1976年，Sanger等在植物類病毒中發現了一種共價閉合的單鏈環狀RNA分子，稱之為環狀RNA(circRNAs)。隨后又有研究者相繼在酵母線粒體等多處發現circRNAs。但由于當時檢測技術的局限性，circRNAs被認為是外顯子轉錄發生錯誤剪接形成的干擾產物，并未引起人們重視。對circRNAs結構和功能的研究不僅幫助我們深入了解腫瘤的發生機制，而且為腫瘤的診斷和治療提供新的方向。有研究表明，circRNAs在食管癌中表達顯著改變，具有腫瘤早期診斷的潛在應用價值。由于在食管癌中表達改變的circRNAs較多，表達上調或下調不一，本文就circRNAs的特征、生物學功能及其在食管癌中的作用進行綜述。

1 circ RNAs

1.1 circRNAs的結構與特點

長鏈非編碼RNA(lncRNAs)、環狀RNA(circRNAs)和小RNA(miRNAs)，這3種非編碼RNA約占真核細胞RNA總量的95%。與傳統的線性RNA相比，circRNAs的5′和3′末端連接在一起，反向剪接形成共價閉合環狀RNA結構，不受RNA外切酶影響，因此不易降解，更為穩定。自circRNAs在病毒中被發現以來的近40年中，circRNAs被認為是錯誤的和無功能的轉錄片段。隨著高通量測序技術的迅速發展，circRNAs被證實了在轉錄體中廣泛存在。circRNAs被認為是影響細胞分化和組織穩態以及疾病發展的重要調節因子。circRNAs主要定位于細胞質中，在真核細胞中表達豐富，具有組織特異性且高度穩定。

1.2 circ RNAs的功能

1.2.1 吸附miRNA

circRNAs通過miRNA結合位點結合miRNA，解除miRNA對其靶基因的調節作用，阻止miRNA在3′非翻譯區與mRNA相互作用，升高miRNA下游靶基因的表達水平，發揮競爭性內源RNA(ceRNA)作用。2013年，研究報道，小腦變性相關蛋白-1(cerebellar degeneration-related protein 1，

CDR1

)基因起源的環狀RNA(ciRS-7)可以結合吸附miR-7，降低miR-7的活性，間接上調miR-7相關靶基因的表達(圖1)。由于環狀RNA的穩定性，在機體內對microRNA的吸附能力要強于線性mRNA和lncRNA。環狀RNA E3泛素蛋白連接酶(circular RNA itchy E3 ubiquitin protein ligase，circ-ITCH)與miR-330-5p結合后通過上調沉默信息調節因子(silent information regulator，SIRT6)、生存素(Survivin)和心肌細胞肌漿網Ca-ATP酶(sarcoplasmic reticulum calcium pump，SERCA2a)，降低阿霉素誘導的心肌細胞損傷和功能障礙，是阿霉素致心臟毒性治療的新靶點。

圖1 circRNAs結合miRNA[7]

1.2.2 調控基因表達

circRNAs可以順式調控親本基因的表達。一方面，circRNAs與RNA結合蛋白(RBP)結合，改變剪接模式或mRNA穩定性，影響親本基因mRNA的表達。另一方面，環狀RNA形成過程中內含子間競爭性互補配對可以與線性RNA之間達成一種平衡，影響mRNA的表達，甚至蛋白翻譯。circRNAs雖然屬于非編碼RNA，但有部分circRNAs可被核糖體翻譯并編碼多肽，進而發揮調控功能。

1.2.3 潛在的腫瘤標志物

circRNAs具有特殊的環狀結構，不易被RNA外切酶降解，穩定性顯著優于線性RNA，并廣泛存在于腫瘤組織、血液及其他體液中。有研究表明，circRNAs在肝癌、胃癌、食管癌、結直腸癌等腫瘤中表達顯著改變，具有腫瘤早期診斷的潛在價值。如hsa-circ-0008934在肝細胞癌組織中高表達，且與較大腫瘤直徑、高水平AFP、癌細胞低分化程度及較差的預后密切相關。circ-0005075在結直腸癌發展過程中參與細胞黏附，其表達與腫瘤大小有關，具有良好的診斷潛力。circ-0067934位于細胞漿內，在食管鱗癌中顯著高表達，沉默其表達可以抑制細胞的增殖和遷移，阻斷細胞周期的進展。

2 circRNA與食管癌

在關于circRNAs與食管癌的相關研究中，我們發現40余項研究報道了28個circRNA在食管癌中表達有改變，其中23個circRNA在食管癌中表達上調，5個circRNA在食管癌中表達下調，結果見表1。

表1 食管癌中表達改變的circRNA及其目標miRNA

2.1 食管癌中表達上調的circ RNAs

我們檢索后發現，circRNAs在食管癌中以表達上調為主，作用機制主要是通過內源性競爭結合目標miRNA位點，調控信號傳導通路。下面我們選擇研究報道相對較多，在食管癌中表達上調的circRNA-ciRS-7、hsa-circRNA-0067934、circRNAPRDM5和hsa-circRNA-100873的作用機制進行概述。

2.1.1 circ RNA-ciRS-7

Li等研究發現：在食管癌組織中circRNA-ciRS-7表達顯著高于正常食管組織，而且ciRS-7的上調與食管癌臨床病理特征與預后不良密切相關。ciRS-7的靶向分子是miR-7，它結合miR-7后，通過激活其下游HOXB13(homeobox B13)介導的NF-κB/p65通路而發揮作用(圖2)。已有的研究表明miR-7能夠直接靶向下調腫瘤相關信號通路中的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate，IRS-1)、磷酸肌醇3激酶催化亞基δ(phosphoinositide 3-kinase catalytic subnit delta，PIK3CD)等致癌因子，具有明顯的抑瘤作用，而ciRS-7的過表達使miR-7的抑瘤作用消失。ciRS-7/miR-7/HOXB13通路在食管鱗狀細胞癌中異常激活，可能是食管癌治療的特異性靶點。Huang等的研究結果也表明ciRS-7在72.4%的食管癌組織和KYSE150、KYSE140、KYSE70、Eca9706等食管癌細胞系中均高表達，能夠顯著增強食管癌細胞的遷移和侵襲能力。miR-7的過表達或鋅指轉錄調節蛋白-4(Krüppel-like factor 4，

KLF-4

)基因敲除均能減弱ciRS-7在食管癌中的腫瘤促進作用。ciRS-7通過miR-7/KLF4調節和活化食管癌NF-κB/p65信號通路，同時，ciRS-7也可通過IKKα信號途徑上調p65的表達，調控NF-κB/p65信號通路。

圖2 ciRS-7結合miR-7調控HOXB13/p-P65信號通路[15]

Sang等研究發現，食管癌中ciRS-7表達顯著上調，與食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關。ciRS-7中有19個miR-876-5p結合位點，能夠特異性結合miR-876-5p。ciRS-7通過靶向miR-876-5p/MAGE-a，調控miR-876-5p介導的MAGE-a家族在食管癌中的抑制作用，增強癌細胞的生長和轉移。

2.1.2 hsa-circ RNA-0067934

Hsa-circ-0067934位于人類染色體3q26.2，包含2個外顯子(圖3)，這兩個外顯子通過背部反向剪接形成hsa-circ-0067934。研究發現，hsa-circ-0067934在食管鱗狀細胞癌中顯著過表達，體外實驗證實：干擾hsacirc-0066934的表達能夠抑制食管鱗狀癌細胞的增殖和遷移并阻斷細胞周期進程，認為hsa-circ-0066934是食管鱗狀細胞癌潛在生物標志和治療靶標。

圖3 外顯子通過染色體3q26.2的反向剪接形成hsa-circ-0067934[13]

2.1.3 circ RNA-PRDM5

胡學廷等研究發現，在食管鱗狀細胞癌組織中circRNA-PRDM5表達顯著高于癌旁正常組織。同時體外細胞試驗也證實circRNA-PRDM5在食管癌細胞系中高表達，通過siRNA沉默circRNA-PRDM5在食管癌細胞中的表達后，KYSE150和ECA109食管癌細胞的遷移和侵襲功能明顯受到抑制。將合成的circRNA-PRDM5干擾序列轉染擴增后接種到裸鼠體內，裸鼠瘤體生長速度顯著慢于對照組，結果表明干擾circRNA-PRDM5的表達能夠顯著抑制食管癌細胞的成瘤能力。

2.1.4 hsa-circ RNA-100873

Zheng等研究發現食管癌組織中hsa-circRNA-100873表達顯著高于正常組織，且在淋巴結轉移食管癌組織中的表達顯著高于無淋巴結轉移組織，提示其在腫瘤轉移中可能發揮重要作用，hsa-circRNA-100873的上調可能與食管鱗癌淋巴轉移密切相關。已報道的在食管癌中表達上調的circRNA還有環狀RNA蛋白激酶C(circular RNA protein kinase C，circ-PRKCI)、circRNA-100367、hsa-circRNA-0000654等，通過體內體外試驗均已證實其在食管癌組織和食管癌細胞系中過表達，作用機制主要是內源性競爭結合目標miRNA位點，通過miRNA影響PI3K-AKT、STAT3、mTOR等信號通路，影響細胞增殖、分化和侵襲。上調的circRNA是食管癌發生發展的促癌因素，干擾或沉默這些circRNAs的表達可抑制食管癌細胞的增殖和侵襲。

2.2 食管癌中表達下調的circRNAs

已報道的在食管癌中表達下調的circRNAs僅有circ-ITCH、circ-VRK1、circ-LARP4、circRNA-0043898和circ-SMAD7共5個，我們選擇了相關研究報道較多的circ-ITCH和circ-VRK1進行概述。

2.2.1 circ-ITCH

circ-ITCH位于人類染色體20q11.22。研究表明，circ-ITCH的異常表達與前列腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、結直腸癌和食管鱗狀細胞癌等多種腫瘤的發生和發展密切相關。在食管鱗癌中，circ-ITCH通過結合miR-7、miR-17和miR-214，增加ITCH表達。過表達的ITCH促進磷酸化Dvl2的泛素化和降解，抑制Wnt/β-catenin途徑，通過調節Wnt途徑抑制食管鱗癌的發生與發展。

2.2.2 circ-VRK1

He等研究報道，在食管癌組織和KYSE150、KYSE450、EC109和Eca9706食管癌細胞系中，發現circ-VRK1表達均顯著下調，同時發現過表達的circ-VRK1能夠顯著抑制癌細胞增殖，增強癌細胞對放射治療的敏感度。circ-VRK1通過增加E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達，降低Ncadherin、Vimentin等表達逆轉上皮細胞間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)，降低癌細胞遷移和侵襲能力。miR-624-3p是食管癌的促發因子，沉默miR-624-3p表達后，KYSE150和KYSE450食管癌細胞生長明顯受到抑制。Circ-VRK1能夠通過結合miR-624-3p調控PTEN表達，miR-624-3p過表達或PTEN敲除均能逆轉過表達circ-VRK1的癌細胞的生長抑制和放射敏感性，進一步明確了circ-VRK1-miR-624-3p-PTEN-PI3K-AKT途徑影響食管癌細胞增殖、分化的作用機制。

在食管癌中表達下調的circRNA還有circ-LARP4、circRNA-0043898和circ-SMAD7。circ-LARP4通過結合miR-1323調控PI3K/AKT信號通路，circRNA-0043898通過影響H3和BMI1表達，影響癌細胞的增殖和分化。下調的circRNA作為潛在的食管癌抗癌靶基因仍需要進一步深入研究，為食管癌的早期診斷和靶向治療提供理論依據。

3 展望

隨著高通量測序和生物信息技術的飛速發展，對circRNAs的認識逐漸深入。雖然對circRNAs的相關研究仍處于起步階段，circRNAs分析算法的準確性亦有待進一步提高，但circRNAs具有廣泛性、穩定性及特異性等特性均預示它在未來可能作為一種新型的生物標志物和腫瘤治療靶點。當前的研究主要集中在其表達改變和作為RNA海綿的吸附作用上，對于circRNA表達改變和調控基因表達的分子機制尚不明確，多數circRNAs與其親本基因的關系亦不清楚，對于不同類型的食管癌與circRNAs表達關聯性的研究報道也還較少。隨著研究的不斷深入，越來越多與腫瘤相關的circRNAs被發現，但circRNAs的命名還不夠規范，亟須建立circRNAs的通用標準和規范。

circRNAs不僅與食管癌緊密相關，和其他多種疾病亦關系密切，并在這些疾病的發生發展中起重要的調控作用。因此，它有望在日后成為一種高效能的臨床標記物和特異性的治療靶點，為某些疾病的早期診斷和靶向治療提供新途徑。