二甲雙胍對DEHP和DBP誘導的MCF-7細胞增殖和遷移的抑制作用

程 斌，王新宇，孫 鈺，張家泰，董淑英，

（1．哈爾濱醫科大學公共衛生學院環境衛生教研室，黑龍江 哈爾濱 150081；2．上海健康醫學院，上海 201318)

鄰苯二甲酸酯(phthalates，PAEs)是一組多元化合物，是具有內分泌破壞特性的工業化學物，屬于環境內分泌干擾物(environmental endocrine disruptors，EDCs)的一種。常見的兩種PAEs類型是鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)和鄰苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate，DBP)。DEHP和DBP在飲用水、空氣和血液中均有較高的檢出率。Chen等檢測室內場所PM中6種PAEs，發現其主要成分為DEHP和DBP，占PAEs總量的76.3%～97.7%。DEHP和DBP具有抗雄激素效應，在低濃度下模擬雌激素對健康產生影響。有流行病學調查發現，DEHP和DBP的暴露與乳腺癌的風險相關。其中高水平的DBP暴露導致雌激素受體陽性乳腺癌發病率增加約兩倍。劉明奇等的病例對照研究結果顯示DEHP和DBP的暴露可能會增加乳腺癌發生的風險。但目前針對DEHP和DBP誘導MCF-7增殖的機制還不是很清楚，有待進一步研究。

二甲雙胍(metformin)是公認治療2型糖尿病的一線藥物。近年來，研究發現二甲雙胍可以通過調控信號通路和改善血糖等途徑發揮細胞周期阻滯、促進細胞凋亡、改善腫瘤微環境以及抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的作用。Collins等的研究結果發現二甲雙胍通過降低雌激素受體的表達以及調節哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路減弱雌激素的促癌細胞增殖作用。流行病學研究表明，服用二甲雙胍可顯著降低糖尿病患者的癌癥發病率和死亡率，尤其是在乳腺癌中有顯著作用。目前，許多研究關注于DEHP和DBP的毒性作用以及二甲雙胍的抗癌作用，但尚無實驗將二甲雙胍作為保護劑抑制DEHP和DBP的毒性作用。因此，本研究以乳腺癌MCF-7細胞為研究對象，初步探討二甲雙胍對DEHP和DBP誘導的MCF-7增殖和遷移的抑制作用，為二甲雙胍作為乳腺癌保護劑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

乳腺癌MCF-7細胞由哈爾濱醫科大學第三附屬醫院惠贈，DMEM細胞培養基購于美國Gibco公司；四甲基噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)、二甲雙胍購于美國Sigma公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于德國BioFrox公司；鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)購于東京化成工業株式會社；鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)購于北京益利精細化學品有限公司；LY294002(PI3K抑制劑)和0.25%胰酶購于上海碧云天生物技術有限公司；優級胎牛血清購于澳大利亞NQBB；細胞培養瓶、細胞培養板(96/24/6)購于美國Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

乳腺癌MCF-7細胞接種到5 mL含10%的胎牛血清的高糖型DMEM培養瓶中(25 cm)，置37℃、CO體積分數為5%的培養箱中常規培養，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，取對數生長期細胞進行試驗。

1.2.2 MTT實驗

收集細胞，每孔加入100μL細胞懸液，鋪板調整細胞密度至1 000～10 000個/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。培養箱中孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，根據預實驗，分別選用二甲雙胍(2.5、5、10、20 mg/mL)，DEHP(20、40、100、200、400μg/mL)，DBP(0.14、0.28、0.7、1.4、2.8、14、28μg/L)。設DEHP、DEHP+二甲雙胍、DEHP+LY294002，DBP、DBP+二甲雙胍、DBP+LY294002共6組，作用于MCF-7細胞48 h。倒置顯微鏡下觀察。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20μL(即0.5%MTT)，繼續培養4 h后終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫檢測儀測量各孔的吸光度

D

(490)值。實驗重復3次，數據取3次的平均值。

1.2.3 劃痕-損傷修復實驗

取對數生長期的MCF-7細胞，常規消化、計數，接種6孔板，每孔接種細胞數為l×10/mL，37℃，CO體積分數為5%條件下培養至80%～90%匯合時，用100μL槍頭末端在6孔培養板中央劃痕，用PBS輕輕沖洗細胞碎片，更換培養基，孵箱中培養，以DMSO作為對照組，DEHP、DEHP+二甲雙胍、DEHP+LY294002，DBP、DBP+二甲雙胍、DBP+LY294002作為實驗組，分別在劃痕后0、24、48和72 h觀察劃痕愈合情況。

1.2.4 腫瘤細胞體外遷移實驗

取對數生長期的MCF-7細胞，常規消化，用DMEM培養基制成單細胞懸液。24孔板每孔用10%胎牛血清的DMEM培養液定容至600μL，每個實驗組設3個平行樣，并放入Transwell小室。調整細胞濃度為5×10個/mL，小室內加入100μg/mL的DEHP、0.7μg/L的DBP和20 mg/mL的二甲雙胍，分組情況同1.2.3，補充無血清培養基至200μL，培養箱中常規培養48 h。取出小室，將濾膜上層細胞用棉簽抹去，濾膜用4%多聚甲醛固定15 min，然后結晶紫染色20 min，PBS洗凈，風干鏡檢，400倍光鏡下選擇膜上、下、左、右、中5個不同視野觀察并計數穿膜細胞數，求平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DEHP和DBP誘導的MCF-7細胞的增殖及二甲雙胍的抑制作用

2.1.1 細胞增殖實驗

DEHP在200μg/mL，DBP在1.4μg/L時對乳腺癌的增殖效果最強，均出現低濃度促進乳腺癌增殖作用強于高濃度的現象，見圖1A和圖1B。二甲雙胍在最大濃度20 mg/mL時對乳腺癌細胞的抑制作用最強(圖1C)，因此選用二甲雙胍20 mg/mL作為最佳抑制濃度。根據圖中的增殖曲線，選擇DEHP 20～200 μg/mL，DBP 0.14～1.4 μg/L時 在DEHP、DBP中分別加入20 mg/mL二甲雙胍，如圖1D和E所示，發現二甲雙胍可以抑制DEHP、DBP所誘導的乳腺癌細胞的增殖，差異均具有統計學意義(

P

＜0.05)。選用LY294002(PI3K/AKT通路阻斷劑)分別加入到DBP和DEHP中，發現細胞增殖減弱，其結果具有統計學意義(

P

＜0.05)。

圖1 MTT實驗結果

2.1.2 細胞形態學改變

各組細胞的生長情況見圖2，20～200μg/mL DEHP和0.14～1.4μg/L DBP單獨作用于細胞48 h，細胞增長迅速，細胞數量增加，與對照組相比，差異具有統計學意義(

P

＜0.05)。在DEHP+二甲雙胍、DBP+二甲雙胍實驗組中，細胞數量并無明顯增加，細胞發生皺縮，細胞形態發生改變，細胞周圍有細胞碎片生成，與DEHP和DBP單獨作用時相比，細胞數量減少(

P

＜0.05)。

2.2 DEHP和DBP誘導的MCF-7細胞的遷移及二甲雙胍的抑制作用

2.2.1 劃痕-損傷修復實驗

在增殖實驗過程中，DEHP和DBP分別在100μg/mL和0.7μg/L時，二甲雙胍的抑制效果最好，因此選用DEHP 100μg/mL，DBP 0.7μg/L做細胞遷移實驗，結果見圖3。與溶劑對照組相比，DEHP和DBP單獨染毒組的劃痕愈合率較高。為了驗證DEHP和DBP是否通過PI3K/AKT信號通路誘導MCF-7細胞的遷移，在DEHP和DBP中分別加入LY294002，與DEHP和DBP的單獨染毒組相比，DEHP+LY294002、DBP+LY294002實驗組的劃痕愈合率較低，且隨著時間的推移，其劃痕愈合率的差距明顯，72 h時差異具有統計學意義(

P

＜0.05)。在DEHP、DBP中分別加入20 mg/mL二甲雙胍，發現二甲雙胍可以抑制DEHP、DBP所誘導的乳腺癌細胞的遷移，72 h時差異具有統計學意義(

P

＜0.05)。

圖2 細胞形態學改變及分析

圖3 劃痕-修復愈合率分析

2.2.2 Transwell遷移實驗

與溶劑對照組相比，DEHP和DBP可以明顯促進MCF-7細胞的遷移，遷移的細胞量明顯增加(圖4)。在DEHP+二甲雙胍、DBP+二甲雙胍實驗組中，遷移的細胞量明顯減少，DEHP+LY294002、DBP+LY294002實驗組中MCF-7細胞遷移的細胞量也明顯減少，差異均具有統計學意義(

P

＜0.05，圖5)。

3 討論

圖4 MCF-7細胞的Transwell遷移實驗結果(×400)

圖5 Transwell遷移實驗的統計分析

DEHP和DBP屬于脂溶性有機物，長期暴露于高濃度DEHP和DBP可以在體內長期蓄積，對人體產生持久危害。目前，研究發現鄰苯二甲酸酯大量存在于環境中，Zhang等進行大氣樣品的檢測發現PM中DEHP和DBP的平均濃度分別為136和43.8 ng/m。Luo等對21個國家的瓶裝水進行檢測，發現DEHP檢出率分別高達61.7%，濃度范圍為393～1 499 mg/kg；DBP的檢出率為67.6%，其濃度范圍為21～73 mg/kg，根據歐盟“關于食品接觸塑料制品的規定”，DEHP和DBP分別不得超過1.5和0.5 mg/kg，以此判斷21個國家瓶裝水中DEHP和DBP的濃度超過了安全標準。王宇希等對哈爾濱市居民血液檢測中發現，DEHP和DBP的檢出率分別為86.19%和19.82%，其含量分別為19.29和68.73 ng/mL；孫卓如等對哈爾濱市新生兒臍帶血檢測發現，DEHP和DBP的檢出率分別為99.2%和100%，其含量分別為11.3和24.43 ng/mL，這兩項研究表明，DEHP和DBP在人體血液內有較高水平。Fu等研究發現，尿液中DEHP代謝物與乳腺癌的發病率高度相關，Thomas等研究發現，高濃度暴露于DBP后，乳腺癌發病率增加約2倍。這兩項研究表明，DEHP、DBP與乳腺癌的發生發展有密切聯系。

本研究采用MTT實驗，結果顯示DEHP和DBP在低濃度可以促進MCF-7細胞增殖，高濃度促進乳腺癌增殖效應弱于低濃度，總體出現“倒U”形劑量-效應曲線，該結果與Chen等研究的劑量-效應關系曲線相符，這可能是由于DEHP和DBP在高濃度時產生細胞毒性，促進乳腺癌增殖作用減弱，最終出現該效應曲線。本研究在DEHP和DBP中分別加入LY294002(PI3K/AKT信號通路阻斷劑)，結果發現與DEHP和DBP單獨染毒組相比，細胞增殖明顯減弱。Chen等研究顯示低濃度的鄰苯二甲酸酯(DEHP、DBP、BBP)通過PI3K/AKT信號通路使其相關蛋白P-PI3K、PAKT、PCNA表達增加，誘導MCF-7細胞增殖。推測DEHP和DBP誘導MCF-7細胞增殖可能與PI3K/AKT信號通路有關。

細胞遷移試驗中，細胞劃痕和Transwell遷移實驗表現出具有較好的一致性，與溶劑對照組相比，DEHP和DBP均能夠促進MCF-7細胞的遷移，DEHP和DBP加入LY294002后，DEHP和DBP誘導癌細胞遷移作用減弱。Hsieh等研究發現，AKT磷酸化導致Vimentin蛋白表達增加是DEHP和DBP誘導乳腺癌細胞遷移、侵襲的重要原因，因此推斷PI3K/AKT信號通路在DEHP和DBP誘導乳腺癌遷移、侵襲方面起重要作用。

大量研究表明二甲雙胍可以抑制癌細胞的增殖和遷移。本研究中，二甲雙胍可以明顯抑制MCF-7細胞增殖，且細胞活性隨二甲雙胍濃度增加而逐漸下降。將二甲雙胍分別加入DEHP和DBP中，發現二甲雙胍可以抑制DEHP和DBP誘導的MCF-7細胞的增殖和遷移。

本研究結果發現，低濃度DEHP和DBP可誘導MCF-7細胞增殖和遷移，二甲雙胍可以作為保護劑抑制其增殖和遷移，但具體機制還需進一步研究。