無芒隱子草葉片卷曲度和厚度測量方法

張文霞 王春光 王海超 殷曉飛 宗哲英

(1.鄂爾多斯應用技術學院信息工程系，鄂爾多斯 017000；2.內蒙古農業大學機電工程學院，呼和浩特 010018；3.呼和浩特職業學院機電工程學院，呼和浩特 010051)

0 引言

植物葉片是植物進行光合作用的主要場所，其發育狀況直接影響植物的生長[1]。植物葉片卷曲度和厚度是反映植物抗旱性的重要指標[2-3]，深入研究這兩個參數對揭示植物的生長狀況、研究抗旱機制、選育耐旱植物以及實現環境控制具有重要的意義。

葉片幾何參數測量方法主要分為直接法和間接法。直接法通過破壞性取樣后進行測量，常見的有九宮格法、稱重法、求積儀法等[4-5]，該類方法主要依靠人工操作，測量精度低且費時費力，不能進行大規模數據測量；間接法主要利用相關儀器測定參數值[6]，該類方法設備價格昂貴、操作繁瑣、維修成本高[7]，且不適合大規模數據測量。隨著計算機技術的發展，近年來通過圖像處理方式分析和測量植物葉片幾何參數的方法備受關注[8-13]。此類方法在確保測量精度的前提下，提高了測量速度，且有助于批量測量。目前，多數學者研究的圖像測量方法僅針對平整型植物葉片進行測量，且針對葉面積的測量方法研究較多，而專門針對植物葉片厚度和卷曲度測量的研究卻鮮見報道。

本文以無芒隱子草葉片為研究對象，通過石蠟制片獲取無芒隱子草葉切片圖像，采用紅色灰度化方法結合閾值分割將目標和背景分離，在準確分割的基礎上，提出采用基于Graham算法的最小外接矩形法實現葉片卷曲度的測量，采用矢量積法和角點檢測相結合的凹凸點檢測算法實現葉片厚度的測量。

1 材料與方法

1.1 圖像采集

無芒隱子草葉片采集的試驗樣地在鄂爾多斯鄂托克旗境內，東經106°41′～108°54′，北緯38°18′～40°11′，平均海拔1 800 m，該地區氣候屬于典型的溫帶大陸性季風氣候，日照豐富，四季分明，無霜期短，降水少，全年較干旱。從試驗樣地中選取4個不同退化梯度樣地(對照區CK、輕度退化區LD、中度退化區MD和重度退化區HD)，樣區內主要植被包括無芒隱子草(Cleistogenessongorica)、狹葉錦雞兒(Caraganastenophylla)、短花針茅(Stipabreviflora)、豬毛菜(Salsolacollina)、砂藍刺頭(Echinopsgmelini)等，草地平均高度為8 cm，蓋度僅為10%～25%。

于2016年7—8月，分別在4個退化梯度樣地隨機設立樣方40個，樣方尺寸為0.5 m×0.5 m，在樣方內隨機選取同齡級、健康的無芒隱子草葉片30片，將其裝入標準固定液(Formalin-acetic acid-alcohol，FAA)，并置于4℃恒溫箱保存以備切片。

將無芒隱子草葉片從FAA標準固定液中取出，經軟化、脫水、透明、浸蠟和包埋、切片、粘片和烘片、染色、封片等步驟完成石蠟制片[14]，獲得永久性玻片，利用生物光學顯微鏡(YYS-80E型)和配套的圖像采集系統CM1400型攝像機結合計算機，采集和存儲圖像。處理與分析圖像的計算機配置為Intel Core i5CPU M480@2.67 GHz，6 GB內存，Windows 7操作系統，圖像處理軟件采用Matlab 2015a。

1.2 目標與背景分割算法

對試驗采集的圖像，首先提取圖像的R、G、B分量，根據圖像特征確定灰度化方法，然后設計矩形結構元素，通過形態學開運算剔除粘連噪聲，接著設計濾波器掩模矩陣，進行線性濾波以消除鋸齒狀邊界，最后，采用最大類間方差(Otsu)方法自動選擇閾值進行二值處理，實現目標和背景的分割。

1.2.1灰度化

彩色圖像灰度化直接影響最終分割精度，常用的灰度化方法有分量法、最大值法、平均法和加權平均法。為了提高算法魯棒性，需要根據無芒隱子草葉片切片圖像的特點選取合適的灰度化方案。

本文隨機選取30幅測試圖像，R、G、B通道的均值分別為197.7、197.5、190.8。為了較好地實現目標與背景的分離，使用紅色特征灰度化方法，但圖像中含有較高藍色B分量，通過增大R、減小G和B[15]來調整三色權重，適合無芒隱子草葉片解剖圖像的灰度化方法為

Gray=2.8R-1.1G-1.4B

(1)

式中Gray——灰度

為定量評價本文灰度化方案的有效性，采用圖像信息熵(Entropy)、圖像平均梯度(Average gradient)和圖像對比度(Contrast)3個指標進行評價。

1.2.2形態學開運算

開運算處理可以斷開狹小間斷和消除細突出物，使對象輪廓變平滑。構造大小為5×20的矩形結構元素H，對灰度化圖像I進行開運算。

I°H=(I?H)⊕I

(2)

式中 ° ——開運算符號

?——腐蝕運算符號

⊕——膨脹運算符號

1.2.3線性濾波

線性濾波可以消除鋸齒狀邊緣，在M×N的圖像I上，用大小為m×n的濾波器掩模進行線性濾波，計算公式[16]為

(3)

其中

a=(m-1)/2b=(n-1)/2

式中g(x,y)——濾波輸出圖像

w(s,t)——空間濾波器

1.2.4最大類間方差

最大類間方差法是一種非參數化的全局閾值分割方法，是圖像分割中自動閾值選取的最佳算法[17-18]。

1.2.5分割質量評價

為定量評價算法分割效果，本文在總結現有評價指標的基礎上，采用誤檢率[19](False positive rate，FPR)、漏檢率[20](False negative rate，FNR)和整體分割精度(Global segmentation accuracy，GSA)[21]作為評價指標，對算法有效性進行檢驗，所需的金基準分割圖通過Photoshop軟件手動分割獲得。FPR、FNR值越小，GSA值越大，分割精度越高。

1.3 目標參數測量

葉片卷曲度和厚度是葉片的重要參數指標，其定義如圖1所示，葉片卷曲度(LW)為葉片圖像中最遠兩點間的距離；葉片厚度(TL)為葉片上、下角質層之間的距離，在實際測量中，葉片厚度為圖像左右邊界上凹點與凹點、凸點與凸點之間的距離。在1.2節圖像分割的基礎上，根據目標參數實際測量方式，采用圖像處理的方法實現葉片卷曲度和厚度的測量。

1.3.1葉片卷曲度測量

結合無芒隱子草葉片解剖結構圖像輪廓的特點，采用8-鄰域邊界跟蹤算法[22]獲得圖像邊界上所有像素點，應用Graham算法[23-24]構造凸包，搜索葉片解剖結構圖像的最小外接矩形(Minimum bounding rectangle，MBR)，從而求出葉片卷曲度。算法的具體步驟為：

(1)采用8-鄰域邊界跟蹤算法提取圖像邊界，設邊界點坐標集為S。

(2)采用Graham算法構造圖像輪廓凸包。①尋找S中距離y軸最近的點設為基點P0。②將S中其余點和基點P0構成向量，并根據極角由小到大排序，記為P0,P1,…,Pn，如果有多個相同的極角點，只保留極徑最大的點。③將P0、P1、P2入棧。④對任意點Pi，如果棧頂的2個點與其不構成“左旋”關系，則將棧頂的點出棧，直到沒有點出棧，再將當前點進棧。所有點處理完之后，最后棧中保存的點為目標圖像完整凸包。

(3)提取葉片最小外接矩形。①隨機選取凸包左右兩端點，設為A(x1,y1)、B(x2,y2)，構成起始邊AB，以點A為中心旋轉角θ，使該邊平行于x坐標軸。②凸包上的所有點圍繞點A旋轉角θ。③以AB為上(下)邊界，找到y值最小(最大)的一個點，經過此點作平行于x軸的直線，這就確定了下(上)邊界。然后找到x值最小和最大的左側點和右側點，經過這兩個點分別做垂直于x軸的兩條直線，確定對應的左右邊界。這樣即可得到一外接矩形，計算并保存邊AB、旋轉角θ，此時記錄外接矩形的頂點坐標和面積。④順序選擇下一條邊BC，若此邊已經選擇，則順序執行，否則跳轉至步驟①，比較所有外接矩形的面積，找出其中面積最小的外接矩形。⑤根據步驟③中的記錄，求出葉片的卷曲度。

1.3.2葉片厚度測量

本文在提取葉片外邊界的基礎上，應用改進的凹、凸點檢測算法提取圖像外邊界的凹點和凸點，最后進行凹點與凹點匹配、凸點與凸點匹配，應用歐幾里得距離計算出葉片厚度。

傳統矢量積法檢測出大量與實際測量不相符的無用點，給后續準確匹配凹凸點帶來不便，為獲得較為準確的、符合實際測量點的凹點和凸點，本文提出將角點檢測和矢量積法相結合的凹凸點檢測算法，算法首先采用最小周長多邊形近似法獲取輪廓頂點，應用自適應閾值和支持動態區域的曲率尺度空間角點檢測算法[21]預選出候選的凹凸點，結合矢量積法檢測出頂點的凹凸性，剔除角點中非凹、凸點，剩余角點即為有用的凹凸點。算法具體步驟為：①求無芒隱子草葉片解剖結果圖像的最小外接矩形，并對其進行旋轉，使得長軸平行于y坐標軸。②獲取無芒隱子草葉片解剖結構圖像最小周長近似多邊形和頂點集合Pv(v=1,2,3,…)。③根據矢量積法獲取凹點集Pa和凸點集Pt。④填充步驟①中獲得的無芒隱子草葉片解剖結構圖像的邊緣輪廓斷裂點，找到T形角點。⑤計算輪廓上每個點的曲率。⑥將局部曲率最大值點設為候選角點，并根據自適應閾值剔除圓角點，同時剔除因噪聲和細節產生的偽角點，閾值設定和偽角點判斷準則見文獻[25]。⑦在較低尺度下對已確定的角點定位。⑧比較T形角點與提取出角點的距離，剔除兩個相隔較近的其中一個角點，得到最終正確的角點集C。⑨將C設為候選凹凸點集，分別與Pa和Pt中的點進行距離對比，從而將C中的點分為凹點集C1和凸點集C2。⑩對C1和C2中的點分別按照y坐標的升序排序。以y坐標值最大點為分界點，將C1和C2分別分為左右集合：凹點左集合(C1l)、凹點右集合(C1r)、凸點左集合(C2l)、凸點右集合(C2r)。將C1l與C1r中的點根據距離進行凹點匹配，并求出匹配點之間的歐氏距離，同樣，將C2l和C2r中的點根據距離進行凸點匹配，并求出匹配點的歐氏距離，進而求出葉片厚度。

2 試驗與結果分析

2.1 灰度化處理

對任意選取的30幅無芒隱子草葉片解剖結構圖像進行試驗，圖2為分別采用不同方法處理后的效果圖，由圖2可知，采用本文方法處理后，能夠明確區分維管束、泡狀細胞、葉肉組織等解剖結構，圖像對比度明顯提升。

表1給出了任意選取的30幅圖像經本文方法處理后的圖像信息熵、平均梯度、對比度，并與分量法、最大值法、平均法、加權平均法進行對比，結果顯示，采用本文方法處理后，圖像的各項指標均明顯高于其余4種方法處理后的結果。

表1 不同灰度化方法處理效果評價

圖3為應用不同灰度化方法對無芒隱子草葉片解剖結構圖像灰度化后，經形態學開運算、線性濾波和閾值分割后的分割結果對比圖，由圖3可知，本文提出的方法使目標分割結果更為完整、準確。

2.2 目標和背景分割試驗

圖像灰度化處理后，經形態學開運算、線性濾波、閾值分割，獲得最終分割結果，如圖4所示。試驗提取了參照圖目標邊界(圖4e)，并將提取的邊界疊加于分割結果圖(圖4f)，結果顯示，分割后的目標區域與目標原邊界基本吻合。

表2給出了30幅圖像試驗的平均誤檢率、平均漏檢率和整體分割精度。由表2可知，平均誤檢率為0.75%，平均漏檢率為3.49%，整體分割精度達到98.14%。結果表明本文算法能夠實現目標和背景的精確分割，滿足后續特征參數測量需求。

表2 分割效果評價結果

2.3 目標參數測量試驗

2.3.1葉片卷曲度測量

圖5為目標卷曲度測量試驗示例，由圖5可知，對于任意朝向的無芒隱子草葉片圖像均可以求得其最小外接矩形，最小外接矩形長度與無芒隱子草葉片卷曲度的實際測量方式結果相符。

表3為本文方法測量值與顯微鏡自帶軟件ToupTek Toupview交互式多次測量均值對比，由表3可知，本文方法測量值與交互式測量均值平均相對誤差為0.96%，速度提高了約10倍，結果表明本文方法可以準確測量無芒隱子草葉片卷曲度。

表3 葉片卷曲度測量值與交互式測量值比較

2.3.2葉片厚度測量

試驗過程示例如圖6所示，結果顯示，傳統的矢量積法檢測出較多與實際測量不相符的凹凸點(圖6d)，本文方法剔除了許多無用點(圖6e)，最終實現的凹點與凹點、凸點與凸點之間的連線與實際測量方式相符。

表4給出了30幅測試圖像應用本文方法測量與應用顯微鏡自帶軟件ToupTek Toupview交互式測量均值對比，由表4可知，通過本文方法測量的平均相對誤差僅為3.69%，速度提高了約37倍，說明本文方法可以較為準確地測量無芒隱子草葉片厚度，且極大地提高了效率。

表4 葉片厚度測量值與交互式測量值比較

3 結論

(1)提出了適合無芒隱子草葉片解剖結構圖像的紅色灰度化方案，并與分量法、最大值法、平均法、加權平均法進行對比，結果表明，本文方法優于其他4種方法。使用最大類間方差結合形態學開運算和線性濾波，實現了無芒隱子草葉片解剖結構圖像目標和背景的準確分割，30幅圖像分割的平均誤檢率為0.75%，平均漏檢率為3.49%，平均整體分割精度達到了98.14%。

(2)提出了采用Graham算法構造凸包的最小外接矩形法，實現了葉片卷曲度的準確測量。將測量值與交互式測量均值進行了對比，30幅測試圖像的平均相對誤差為0.96%，速度提高了約10倍。

(3)提出了角點檢測和矢量積法相結合的凹凸點檢測算法，結合凹點匹配和凸點匹配實現了葉片厚度的準確測量，將測量值與交互式測量均值進行了對比，30幅測試圖像的平均相對誤差為3.69%，速度提高了約37倍。

(4)本文通過圖像處理手段實現了無芒隱子草葉片解剖結構特征參數的提取和測量，克服了人工交互測量效率低、實現性差的缺點。