基于BSA-Seq和RNA-Seq方法鑒定大豆抗豆卷葉螟候選基因

曾維英 賴振光 孫祖東 楊守臻 陳懷珠 唐向民

基于BSA-Seq和RNA-Seq方法鑒定大豆抗豆卷葉螟候選基因

曾維英**賴振光**孫祖東*楊守臻 陳懷珠 唐向民

廣西農業科學院經濟作物研究所/ 農業農村部西南玉米大豆間套作區農業科學觀測實驗站, 廣西南寧 530007

豆卷葉螟(Fabricius)是重要的大豆食葉性害蟲, 挖掘大豆抗豆卷葉螟相關基因對大豆抗蟲品種選育和遺傳改良至關重要。本研究用大豆高抗豆卷葉螟材料趕泰-2-2和高感豆卷葉螟材料皖82-178進行雜交構建F2代分離群體, 從303個F2代單株中挑選出高抗豆卷葉螟和高感豆卷葉螟的單株各30株, 分別構建2個極端性狀的DNA混合池用于全基因組重測序以分析控制豆卷葉螟相關的候選基因。結果表明, 4個樣本中共有11,963,077個單核苷酸多態性(SNPs)標記, 根據SNP-index方法關聯分析, 共有329個基因位于99%置信區間外, 這些基因主要集中在7號染色體5,601,065～5,865,237 bp區間(總長為0.26 Mb)、16號染色體2,975,110～6,336,096 bp區間(總長為3.36 Mb)、18號染色體44,366,115～54,297,600 bp區間(總長為9.93 Mb)等區域內。將BSA-Seq結果與轉錄組測序結果進行聯合分析發現, 有12個基因相關聯; 最后, 結合生物信息學分析、候選基因的表達模式和基因的同源注釋, 鎖定、轉錄因子、、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、等12個基因為控制豆卷葉螟性狀相關的候選基因。本研究結果不僅為解析大豆抗豆卷葉螟的分子機理奠定重要的基礎, 也將為大豆抗蟲基因的克隆奠定堅實的理論基礎。

大豆; 豆卷葉螟; BSA-Seq; RNA-Seq; 候選基因

大豆是我國植物蛋白和食用油的主要來源, 蟲害是影響大豆產量和品質的重要因素。豆卷葉螟(Fabricius)分布于東北、黃淮海及南方地區[1], 是南方和黃淮大豆產區主要食葉性害蟲[2-3], 一年可發生4～5代, 有世代重疊現象, 在溫度、濕度適宜時會大面積發生, 一般造成大豆減產15%～20%, 嚴重時可達30%以上。為害嚴重的年份, 葉片被取食后只剩葉脈和葉柄, 造成產量的嚴重損失[3-5]。

鑒于豆卷葉螟為害的嚴重性, 國內外在大豆抗豆卷葉螟方向展開了深入研究, 已鑒定出高抗豆卷葉螟材料趕泰-2-2、豐平黑豆等, 也鑒定出了高感材料皖82-178、山東大豆等[6-7]; 控制豆卷葉螟的抗性位點主要位于A2、C2、D1a、D1b、H、K和O等連鎖群上[8-10]; 可溶性糖含量、茉莉酸含量、過氧化氫酶和多酚氧化酶活性只與豆卷葉螟誘導有關, 而超氧化物岐化酶活性、乙烯和脫落酸含量與蟲害誘導和材料基因型都有關[11]; 大豆胰蛋白酶抑制劑、查爾酮異構酶4、脂氧合酶9等可能是大豆抗豆卷葉螟潛在的靶標蛋白(基因)[12-14], gma-miR156q、gma-miR166u、gma-miR166b、gma-miR319d、gma-miR394a-3p和gma-miR396e等miRNA可能參與大豆抗豆卷葉螟的抗性調控[15]。

目前, 大豆抗蟲基因主要源于微生物的蘇云金芽孢桿菌(, Bt)殺蟲晶體蛋白基因(), 并轉入大豆中獲得了抗蟲轉基因大豆。郭東全等[16]將構建的和高效雙價殺蟲基因轉入到吉林20與吉林27大豆品種中, 獲得了高效抗蟲且基本穩定遺傳的轉基因抗蟲大豆; 陳秀華等[17]將基因轉化到綏農14中, 得到抗蟲效果較好的轉化植株; 武小霞等[18]將基因轉入黑農35中, 檢測得到抗大豆食心蟲轉基因植株; 朱延明等[19]將具有豆莢特異性啟動子Pmsg的29基因轉入綏農28中, 獲得了對鱗翅目和雙翅目都具有抗性植株; 藍嵐等[20]將抗蟲基因轉入東農50中, 證明轉基因植株對大豆食心蟲具有明顯抗性; 高嵩[21]將抗蟲基因轉入到吉農28中發現, 轉基因植株對大豆食心蟲具有明顯抗性; 美國孟山都公司、陶氏公司將、等目的基因導入大豆中, 獲得對鱗翅目類昆蟲具有強烈殺蟲活性的轉基因抗蟲大豆品種, 并在加拿大、日本、美國展開商業化種植[22-24]。但抗蟲基因屬于外源基因, 轉抗蟲基因大豆對非靶標生物造成了潛在的威脅。因此, 需鑒定出大豆自身含有的抗蟲目的基因并進行遺傳轉化, 獲得抗蟲轉基因材料。

隨著高通量測序技術的興起, 基于全基因組測序的BSA方法在不構建遺傳圖譜的情況下能高效快速地挖掘目標性狀基因, BSA-Seq方法已被廣泛應用在水稻、黃瓜、番茄、大豆等作物中, 并且成功地定位出水稻耐鹽[25]、水稻稻瘟病[26]、黃瓜早花[27]、番茄果實重量[28]、大豆疫霉病[29]等基因。本研究利用高抗豆卷葉螟材料趕泰-2-2與高感材料皖82-178雜交構建F2代分離群體, 通過對親本和2個極端表型子代混合池進行BSA-Seq全基因組重測序, 定位目標性狀關聯區域, 推測與抗豆卷葉螟有關的基因; 再結合前期的轉錄組測序結果, 關注抗蟲性狀候選區域的相關基因的表達水平, 進一步縮小候選基因范圍, 鑒定出控制豆卷葉螟性狀的候選基因, 旨在為更深入的闡明大豆抗豆卷葉螟的分子機制開拓新思路, 為大豆的抗蟲分子育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年利用皖82-178 (高感豆卷葉螟)為母本和趕泰-2-2 (高抗豆卷葉螟)為父本進行雜交, 試驗材料(F2代群體和親本材料)于2020年3月種植在廣西壯族自治區農業科學院院本部試驗田防蟲網室中(東經108.1146°、北緯22.5059°, 紅壤土), 壟長1.5 m、行距0.5 m, 3行區播種, 每行10株, 在大豆整個生育期期間不噴施農藥, 不施用肥料。待植株長至10片復葉時, 按每株3蟲的密度分別接豆卷葉螟4齡幼蟲3頭(用鑷子取3頭蟲接到第9片復葉的中間小葉上), 48 h后以卷包數和卷葉率為評價指標進行抗性鑒定(卷葉率0～10%為高抗、10%～30%為抗、30%～50%為中抗、50%～70%為感、>70%為高感)[7-8]。從303個F2分離群體中挑選30株極端抗豆卷葉螟單株和30株極端感豆卷葉螟單株構建子代高抗混合池和高感混合池, 用于抗豆卷葉螟的基因定位。田間采集相應植株幼嫩葉片。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用改良CTAB法[30]分別提取親本材料(趕泰-2-2和皖82-178)和F2代群體極端個體的DNA, 將極端抗豆卷葉螟植株幼嫩葉片和極端感豆卷葉螟植株幼嫩葉片各30株的DNA等量混合, 制備總DNA 3 μg, 樣品濃度≥20 ng μL-1, 構建高抗子代混合池、高感子代混合池。

1.2.2 文庫構建及測序 由深圳華大基因科技服務有限公司完成樣本建庫和測序。將檢測合格的基因組DNA樣本用Covaris儀超聲波隨機打斷成特定大小的片段, 打斷后的樣本用Agencourt AMPure XP-Medium kit進行片段選擇, 使得樣本條帶集中在200～300 bp左右, 使用試劑盒Qubit dsDNA HS AssayKit, 500 assays檢測純化后DNA樣本量; 對打斷的DNA片段進行末端修復, 在3￠端連接A堿基, 將特定測序引物連接到DNA片段上; 純化連接產物, 選擇合適大小的DNA片段; 將DNA片段在cBot儀器上擴增制備文庫; 對構建的文庫進行質量檢測; 將質量檢測合格的文庫上機測序。對親本池和子代混合池分別開展20×和50×覆蓋度的全基因組重測序。

1.2.3 生物信息學分析 對測序得到的Raw reads進行過濾, 將過濾后的Clean reads運用BWA軟件與大豆參考基因組進行比對[31-32], 將比對結果進行排序、質量過濾和標記duplicate后進行變異類型檢測。使用GATK軟件查找樣本相對于參考基因組之間的SNP, 用Breakdancer[33]軟件來檢測樣本與參考基因組之間的SV位點, 用Control-FREEC[34]軟件來查找樣本相對于參考基因組之間的CNV區域。為得到更準確的變異信息, 對變異位點分別進行進一步的過濾, 使用變異位點注釋軟件Annovar[35]將變異位點在基因組上的位置區域注釋出來。

1.2.4 SNP-index計算 子代群體與親本之間的序列差異程度用SNP-index來表示, 計算經過質量控制后的每一個變異位點在高抗子代池和高感子代池中的SNP-index, 過濾掉2個子代極端混合池里面SNP-index都小于0.3的位點, 只保留雙親純合且有差異、子代混池都為非缺少的SNP位點。同時, 將2個子代池的SNP-index相減得到Delta SNP-index。Delta SNP-index為1或者-1, 說明相對應的SNP來源于其中一個親本, 這一位點所在的基因很有可能是與目的性狀相關的基因。

1.2.5 目的基因的篩選與功能注釋 使用滑窗法對滑窗內的Delta SNP-index進行計算, 取滑窗內所有SNP位點的Delta SNP-index的平均值, 滑窗大小為1.00 Mb, 步長為0.05 Mb, 對Delta SNP-index在各染色體上的分布進行作圖。基于基因組Gff注釋文件, 對所有候選位點進行來源注釋, 挑選出位于基因區的SNP位點, 為縮小篩選范圍, 選取99%置信區間作為篩選閾值, 單獨把Delta SNP-index大于99%置信區間的SNP位點篩選出來進行注釋。利用Blast2go_v2.5軟件對所鑒定的基因進行GO注釋分析, 計算得到的-value通過Bonferroni校正之后, 以Corrected-value≤0.05為閾值。利用Blast_v2.2.26軟件在KEGG pathway數據庫對所鑒定的基因進行Pathway富集分析, 計算得到的- value通過Bonferroni校正之后, Corrected-value≤0.05為閾值。

1.2.6 轉錄組分析 利用TRIzol Kit提取葉片總RNA, 采用Truseq RNA試劑盒進行mRNA純化并構建cDNA文庫, 對獲得的cDNA文庫進行PCR擴增富集, 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 回收目的片段。然后使用Illumina Hiseq 2000測序儀進行對樣本測序。以上試驗均由深圳華大基因科技服務有限公司完成。測序后的數據經Base calling轉化為Raw data或Raw reads, 隨后對Raw reads進行質控。利用SOAPfuse軟件[36]對原始測序數據進行去除處理得到Clean reads。再利用Tophat將Clean reads比對到大豆參考基因組, 允許有2個堿基的錯配[37-38]。表達定量的結果以FPKM (Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)為單位, 在得到差異檢驗的FDR值同時, 根據基因的表達量(FPKM值)計算該基因在不同樣本間的差異表達倍數。以“FDR≤0.001和|log2Ratio (FC, Fold Change)|≥1”作為閾值來判斷基因差異表達的顯著性[39]。

2 結果與分析

2.1 測序質量評估

利用高通量測序技術對親本及子代混合池共4個樣本進行全基因組重測序, 共產生194.54 G原始測序數據, 經過SOAPnuke軟件對數據進行接頭過濾、低質量過濾和去N過濾后, 最終得到191.35 G高質量的Clean Reads數據。GC含量在35.46%～ 35.60%之間, 測序數據質量較高(Q20≥96.29%, Q30≥91.70%) (表1)。由此可知4個樣本的數據量充足, 測序數據可靠, 測序質量合格, GC分布正常, 可進行下一步分析。

使用BWA軟件(https://webblast.ipk-gatersleben. de/barley_ibsc/downloads/), 將4個樣本中質控后的Clean reads比對到大豆參考基因組上, 然后使用Qualimap軟件對比對結果進行統計。其中, 基因組大小是979,046,046 bp, 有效基因組大小為955,932,237 bp (參考序列中不含N), 參考基因組GC含量為33.95%, 4個樣本的比對率介于99.76%和99.81%之間, 平均測序深度在30.78×和65.98×之間浮動(表2)。數據比對率高, 有利于下一步進行SNP檢測。

將測序Reads比對到參考基因組以后, 統計參考基因組上不同染色體區域的覆蓋度和測序深度分布情況。1×覆蓋率百分比超過95.75%, 5×覆蓋率百分比超過94.55%, 10×覆蓋率百分比超過93.29%, 20×覆蓋率百分比超過83.88% (表2)。通過Qualimap軟件對比對結果進行統計, 參考基因組被均勻覆蓋, 隨機性良好, 有利于SNP過濾和篩選。

表1 原始測序數據統計表

表2 質控后測序數據與參考基因組比對結果統計分析

2.2 SNP檢測和注釋

SNP分析結果顯示, 4個樣本中共獲得11,963,077個SNP位點, 其中高感子代混合池中最少, 皖82-178 (高感親本)中最多。SNP位置和編碼信息統計顯示, 同類型材料間(親本間, 子代池間)相同類型的SNP數和比例大體相當(表3)。純合突變SNP比率明顯高于雜合突變SNP比率, 純合突變SNP 比率均高于99.73%。

2.3 候選基因篩選

利用SNP-index方法對檢測到的SNP進行分析, 4個樣本共鑒定出高質量的可信SNP位點11,963,077個。根據SNP-index方法關聯閾值判斷, 所有候選位點對應的基因數量為56,909個, 當擬合后Delta SNP-index置信度為99%時, 20條染色體上共有329個基因位于99%置信區間外, 主要集中在7號染色體5,601,065～5,865,237 bp區間(總長為0.26 Mb, 區間內基因數量為25個)、16號染色體2,975,110～6,336,096 bp區間(總長為3.36 Mb, 區間內基因數量為36個)、18號染色體44,366,115～ 54,297,600 bp區間(總長為9.93 Mb, 區間內基因數量為52個)等區域內, 區間內共包含113個基因(圖1)。1號染色體和19號染色體上沒有檢測到基因, 2號、6號、8號、9號、10號、11號和12號染色體上檢測到的基因數少于10個。

表3 多態性位點注釋統計表

為進一步分析基因所在的亞細胞定位、分子功能及參與的生物學過程, 對所鑒定出的329個基因進行GO功能注釋分析表明, 329個基因中有181個被注釋到20個功能組中(圖2), 包括9個生物學進程、7個細胞組分和4個分子功能, 在生物學進程中, 這些基因主要參與刺激反應、單一生物體過程、代謝過程、細胞過程等生物學過程; 在細胞組分中, 這些基因主要集中在細胞、細胞組分、膜、膜組分等組分; 在分子功能中, 這些基因主要參與結合、催化活性等功能。說明蟲害脅迫下大豆對逆境的響應可能與細胞組織、細胞膜組織等的修復功能有關, 且一些催化活性的酶可能參與到蟲害逆境脅迫中。

為鑒別329個基因參與富集的代謝途徑, 利用KEGG通路數據庫對候選基因進行Pathway富集分析表明, 329個基因中有30個基因主要富集在植物病原菌互作、代謝途徑、次生代謝物的生物合成、RNA降解等通路中(圖3)。表明當大豆受到豆卷葉螟危害以后, 植株體內的防御系統會立即響應刺激, 適當地增加體內的代謝活動, 產生防御物質, 如防御酶、蛋白質抑制酶等物質, 而且增強各種酶的活性來促進防御。

橫坐標為染色體編號, 縱坐標為Delta SNP-index值。不同顏色的點表示不同染色體上篩選后的SNP, 紅色曲線表示滑窗后的Delta SNP-index值, 藍色直線表示99%置信區間值。

The X-axis is the chromosome number, Y-axis is the Delta SNP-index value. Different colored dots represent SNPs screened on different chromosomes, the red curve represents the Delta SNP-index value after the sliding window, the blue line represents the 99% confidence interval.

將BSA-Seq結果預測的基因和轉錄組測序結果[13]進行聯合分析, 將位于99%置信區間以外SNP對應的基因與轉錄組數據進行比對, 獲得轉錄組中的同源序列及基因的表達水平。比對發現共有12個基因在4個比較組中呈顯著性差異表達, 這些基因分別位于2號、12號、16號、18號等9條染色體上(表4), 其中響應豆卷葉螟取食脅迫誘導的基因有8個, 這8個基因中共有7個為顯著上調基因, 分別為環核苷酸門控離子通道4 ()、轉錄因子、赤霉素2-β加雙氧酶8、氨基酸透性酶7 ()、Mdis1相互受體激酶2、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、, 只有纖維素合成酶A催化亞基4 ()為顯著下調基因; 類枯草桿菌蛋白酶、抗病蛋白RGA3和硫氰酸酶結構域蛋白酶10等3個基因在高感材料中的表達量顯著高于高抗材料, 1個未知基因在在高感材料中的表達量顯著低于高抗材料。最后, 結合基因的同源注釋、基因差異表達分析和生物信息學分析等, 推測環核苷酸門控離子通道4 ()、轉錄因子、7、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、等12個基因為抗豆卷葉螟有關的候選基因。

3 討論

基于BSA-Seq的方法挖掘新基因在作物農藝性狀相關的基因定位中的應用日益廣泛, 該方法在構建遺傳圖譜的情況下高效快速地挖掘目的基因[40], 是一種簡單快速、準確的基因定位方法, 已成為育種家進行快速QTL定位和挖掘各種不同作物目標性狀基因的一種有效方法。如Takagi等[25]利用BSA-Seq方法找到控制水稻耐鹽性的候選基因, 僅用2年時間培育出水稻耐鹽性新品種; Lu等[27]利用BSA-Seq方法定位到84個控制黃瓜早花性狀基因并確定基因為候選基因; Illa- Berenguer等[28]利用BSA-Seq方法定位到66個控制番茄果實重量性狀基因; Guo等[41]利用BSA-Seq方法快速定位到29個辣椒抗黃瓜花葉病毒性狀基因并挖掘出2個候選基因; Ma等[42]利用BSA-Seq方法定位到控制水稻低柱頭外露突變候選基因; Zhao等[43]利用BSA-Seq方法鑒定到20個棉花細胞質雄性不育的育性恢復候選基因; 張堯鋒等[44]利用BSA-Seq方法在甘藍型油菜中定位到8個控制有限花序性狀候選基因。BSA-Seq方法也被用于農作物的抗蟲基因定位, Liang等[45]利用BSA-Seq方法定位到1個與黃瓜蚜蟲抗性相關的區域, 該區域內包含40個基因, 其中16個基因可能與蚜蟲抗性有關。利用全基因組重測序與BSA相結合同樣能夠高效和快速鑒定大豆中的目標性狀基因[46], 本研究利用BSA-Seq分析和轉錄組測序分析對控制抗豆卷葉螟性狀相關基因進行了初步定位, 篩選出12個可能與抗豆卷葉螟脅迫相關的候選基因, 再結合生物信息學分析、基因差異表達分析和基因同源性分析發現, 環核苷酸門控離子通道4 ()、轉錄因子、氨基酸透性酶7 ()、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、、類枯草桿菌蛋白酶等6個基因已有報道與抗逆有關。而赤霉素2-b加雙氧酶8、Mdis1相互受體激酶2、抗病蛋白RGA3、硫氰酸酶結構域蛋白酶10和1個未知基因可能是與抗大豆卷葉螟有關的新基因。

表4 候選基因信息表

HR代表抗豆卷葉螟材料趕泰-2-2和HS為高感豆卷葉螟材料皖82-178。數字0和48代表處理時間為0 h和48 h。a上調或者下調代表顯著性上調或者顯著性下調。

HR represents the highly resistant material Gantai-2-2, HS represents the highly susceptible material Wan 82-178. The numbers 0 and 48 represent the processing time of 0 hour and 48 hours.aThe ‘up’ or ‘down’ represents significantly different up or down.

環核苷酸門控離子通道()是一種非選擇性的陽離子通道, 對一價和二價陽離子均有通透性, 是動植物細胞中非常重要的離子通道, 在植物生長發育、生物與非生物脅迫中都發揮著重要作用[47-48]。植物細胞中,是信號轉導級聯系統的組成部分, 是環核苷酸作用的一個主要靶標, 是連接環核苷酸和Ca2+的紐帶。在病原菌入侵的早期, 它能夠參與Ca2+內流的調控[49-50], 將細胞外信號通過陽離子流轉變為胞內信號, 對細胞的生理活動進行調控[51]。當細胞受到外界刺激時, 定位于細胞膜上的受體蛋白識別相應刺激, 并激活胞質內腺苷酸環化酶, 生成的環核苷酸(cAMP)使通道打開, 胞外Ca2+內流[52]。轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一, 在調控植物的生長發育、生物及非生物脅迫等過程中具有十分重要的作用[53-55]。植物遭受昆蟲脅迫后, 植物體內轉錄因子的表達水平會發生變化[56], 如擬南芥受到線蟲危害時,基因被誘導[57]。氨基酸透性酶()是植物中的氨基酸轉運蛋白, 在氨基酸轉運過程中發揮著重要作用[58-59]。基因在植物抵御病原體侵害方面扮演著重要的角色, 如含基因和基因突變體植株能維持根結線蟲生長率低于野生型[60]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是一類重要的信號分子, 當植物遭遇到如害蟲取食、鹽害、干旱等脅迫, 或是受到創傷以及其他細胞因子、激素刺激時, 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶迅速在絲氨酸、蘇氨酸殘基部位磷酸化而激活, 并進一步通過級聯磷酸化作用活化下游的信號分子, 激活特定的信號傳導途徑, 最終將外界信號傳遞到細胞核, 激活或抑制特定基因的表達[61-63]。基因的表達對植物株型發育有重要的調控作用, 該基因的表達水平受植物激素和光照的調節, 最終導致植物株型的變化[64]。類枯草桿菌蛋白酶是一類在植物發育和信號級聯中實現高度特異性功能的絲氨酸蛋白酶, 在植物和病原物互作過程中起到重要的免疫激發作用[65]。推測以上候選基因的功能和參與的代謝途徑可能與大豆抗豆卷葉螟有關, 當大豆受豆卷葉螟誘導脅迫后, 一些候選基因能發生信號轉導、相關基因表達及防御物質生成等一系列的反應來抵御蟲害。大豆抗豆卷葉螟是一個復雜的生理過程, 目前尚缺乏遺傳調控方面的研究, 本研究中通過BSA-Seq技術與RNA-Seq技術相結合, 挖掘出一些與抗豆卷葉螟相關的候選基因, 對于這些基因是否是調控豆卷葉螟的關鍵基因, 以及其調控機理將在后續的工作中進行分析和驗證。

4 結論

通過BSA-Seq全基因組重測序發現共有329個基因位于99%置信區間以外, 主要集中在7號、16號和18號等染色體上。通過結合轉錄組測序結果分析、基因的同源注釋、生物信息學分析等, 初步推測、轉錄因子、7、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、等12個基因為大豆抗豆卷葉螟相關的候選基因, 這些基因可能在大豆抗豆卷葉螟過程中起著重要作用, 為大豆抗豆卷葉螟基因圖位克隆奠定了基礎。

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Identification of the candidate genes of soybean resistance to bean pyralid (Fabricius) by BSA-Seq and RNA-Seq

ZENG Wei-Ying**, LAI Zhen-Guang**, SUN Zu-Dong*, YANG Shou-Zhen, CHEN Huai-Zhu, and TANG Xiang-Min

Institute of Economic Crops, Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Southwest Experimental Station of Maize-Soybean Intercrop, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanning 530007, Guangxi, China

Bean pyralid is an important leaf-feeding insect in soybean. Identification of insect-tolerant genes from soybean has great significant to the crop insect-tolerant breeding and genetic improvement. In this study, an F2population with 303 individuals was constructed using insect-resistant line Gantai-2-2 and insect-sensitive line Wan 82-178. 30 F2insect-resistant individuals and 30 insect-sensitive individuals were selected respectively to construct two DNA pools which were used for the whole-genome re-sequencing. The results showed that there were a total of 11,963,077 single nucleotide polymorphism (SNPs) markers identified in two parental lines and two mixed pools. According to the association analysis of SNP-index method, a total of 329 genes were located outside the 99% confidence interval. These genes were mainly concentrated in the regions of 5,601,065–5,865,237 bp with a total of 0.26 Mb on chromosome 7, 2,975,110–6,336,096 bp with a total of 3.36 Mb on chromosome 16, and 44,366,115–54,297,600 bp with a total of 9.93 Mb on chromosome 18. Correlation analysis of BSA-Seq and transcriptome sequencing showed that 12 genes were correlated. Then, 12 candidate genes, including,transcription factor 16,7, serine/threonine protein kinase andwere identified by bioinformatics analysis, differential expression analysis, and homologous annotation. This study laid an important foundation for the analysis of the molecular mechanism of soybean resistance to bean pyralid and the cloning of anti-insect genes.

soybean; bean pyralid; BSA-Seq; RNA-Seq; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2021.04195

本研究由廣西自然科學基金項目(2017GXNSFDA198037)和廣西農業科學院科技發展基金項目(桂農科2020YM116, 2015YT58)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Guangxi Province, China (2017GXNSFDA198037) and the Science and Technology Development Fund of Guangxi Academy of Agricultural Sciences (Guinongke 2020YM116, 2015YT58).

孫祖東, E-mail: sunzudong639@163.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

曾維英, E-mail: zengweiying_1981@163.com; 賴振光, E-mail: 519229671@qq.com

2020-08-25;

2021-01-13;

2021-02-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210216.1414.002.html