奶牛乳房炎大腸桿菌的生化鑒定

賈文玉，賈曉峰，王英杰，雷雄偉

( 高臺縣羅城鎮畜牧獸醫工作站 ，甘肅 高臺 734300)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢材料甘肅省張掖市高臺縣巷道鎮殷家莊村六社三個養殖場(區)的129份奶樣，經無菌采集，在甘肅省張掖市高臺縣動物疫病預防控制中心實驗室分離、培養觀察后獲得的18份疑似大腸桿菌純培養物。

1.1.2 生物化培養基及試劑培養基：葡萄糖、乳糖、蔗糖、吲哚、MR、VP、硝酸鹽、尿素、枸櫞酸、H2S,試 劑：Ehrlich氏試劑，高硫酸鉀飽和溶液、甲基紅試劑、VP試劑、硝酸鹽試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養基及試劑的配制 (1)糖類分解實驗(葡萄糖、乳糖、蔗糖), 用量：各配100 mL。 配方：蛋白胨0.2 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鉀0.02 g瓊脂0.3 g、蒸餾水、pH調至7.4。加入各種糖類各1 g及質量分數為1.6%的溴甲酚紫0.1 mL。121℃高壓滅菌10 min。(2)吲哚實驗,用量：100 mL, 配方：Dunham氏蛋白胨水溶液：蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、蒸餾水150 mL，pH調至7.6,高壓滅菌，晾干后于4℃保存。 高硫酸鉀飽和液 高硫酸鉀2.65 g，溶解于50 mL蒸餾水中。(3)甲基紅(MR)、VP實驗, 用量：100 mL, 配方：葡萄糖蛋白胨水溶液：葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.5 g、磷酸氫二鉀0.5 g、蒸餾水150 mL,pH調至7.2～7.6, 乙液：氫氧化鉀溶液(氫氧化鉀40 g，蒸餾水150 mL)。裝于棕色瓶中，于4～10℃保存(4)枸櫞酸鹽利用實驗(西蒙氏枸櫞酸鹽), 用量：100 mL； 配方：稱取現成的西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂2.98 g，解熱攪拌溶解于150 mL蒸餾水中，PH調至6.7～6.9，121℃高壓滅菌15 min制成斜面長5～6 cm，底長3～4 cm的斜面培養基，備用。(5)硫化氫試驗(三糖鐵培養基), 用量：100mL； 配方：稱取現成的三糖鐵瓊脂(TSI)6.55 g，加熱溶解于150 mL蒸餾水中，煮沸3 min，分裝于16*150 mm試管，PH調至7.3～7.5，121℃高壓滅菌25 min制成斜面長5～7 cm，底長4～5 cm的斜面培養基，備用。 (6)動力學檢測(半固體培養基), 用量：100 mL； 配方：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鉀0.1 g、瓊脂0.6 g，調pH至7.6，高壓滅菌。

1.2.2 生化試驗 (1)吲哚試驗 取純培養物接種于Dunham氏蛋白胨水溶液，37℃培養2～3d，脫脂棉上加Ehrlich與高硫酸鉀飽和溶液，置于被檢試管上，離液面1.5 cm，水溶煮沸為止，觀察結果。 判定標準：脫脂棉上出現紅色者為陽性。(2)枸櫞酸鹽利用試驗 取純培養物接種于枸櫞酸培養基內，37℃培養18～36 h，觀察結果。 判定標準：培養基轉為黑色者為陽性，以“+”表示。(3)硫化氫試驗取純培養物接種于半固體培養基，37℃培養18～36 h，觀察結果。 判定標準：由運動視為細菌，可由穿刺線向四周擴散生長，使周圍的培養基變成渾濁即為陽性；無運動力的細菌僅能延穿刺線生長，周圍的培養基仍然保持澄清即為陰性。

2 結果與分析

2.1 結果

2.1.1 動力學檢測 經細菌動力學檢測結果顯示，18株菌株中，其中大多數可由穿刺線向四周擴散生長，使周圍培養基變成混濁，即為陽性；而僅有少數能延穿刺線生長，周圍的培養基任然保持澄清，即為陰性。

2.1.2 生化鑒定由上表1可知，18菌株經生化鑒定后，其中只有5株為大腸桿菌，分別為W1Y49、W1Y20、W1Y20、W1Y14、W2L12，其中5株大腸桿菌在葡萄糖及乳糖培養基上均產酸產氣，在蔗糖培養基上僅產酸或呈陰性，吲哚、MR及硝酸鹽培養基上呈陽性，在VP、尿素、枸櫞酸及硫化氫培養基上既不產酸也不產氣，即為陰性。

表1 乳牛乳房炎大腸桿菌的生化鑒定結果

2.2 分析

對比大腸桿菌科中與獸醫學有關的主要屬的生化鑒定表，細菌的動力學檢測大多數檢測為陽性，少數為陰性，判定為腸桿菌屬。

從奶牛乳房炎大腸桿菌生化鑒定的結果來看，W1Y49、W1Y20、W1Y20、W1Y14、W2L12符合大腸桿菌生化鑒定結果，故確定為大腸桿菌。

3 討論

通過對乳樣經無菌采集、分離培養、觀察后獲得的18份疑似大腸桿菌純培養物，經過生化試驗即將該純培養物接種到生化培養基上，37℃培養，來鑒定大腸桿菌。細菌的生化實驗方法有很多種，本實驗中采取了葡萄糖、乳糖、蔗糖、吲哚、MR、VP、等十種生化培養基，將23株疑似大腸桿菌純培養物分別接種于該十種生化培養基上，經培養基觀察其實驗結果，以1984年版《伯吉氏細菌鑒定手冊》和1994年版《伯吉氏細菌鑒定手冊》第9版中相應科、屬下的各個種的生理生化指標為依據，結果證明只有其中的5株(W1Y49、W1Y20、W1Y14、W2L12)為大腸桿菌，其余的均不是。本實驗還將23株疑似大腸桿菌純培養物穿刺培養到半固體培養基上，通過觀察細菌的運動力，也做出了初步的判斷。