離子色譜法測定甜菜糖蜜中甜菜堿含量的研究

張 瑋， 李會榮， 劉 婕

（山東省畜產品質量安全中心，山東濟南250010）

甜菜糖蜜作為一種飼料原料，不僅具有消化吸收快的特點，而且可提高適口性，降低粉塵，提高飼料顆粒質量。將糖蜜作為一種常用的能量飼料添加到奶牛日糧中，可以明顯增加牛乳的產量和提高牛乳中各種營養成分的比例（張捷等，2007）。甜菜堿是一種季銨型生物堿（紀旭，2004），廣泛存在于動植物中，尤以甜菜糖蜜中含量最高，甜菜堿可提供有效的甲基供體、應用于畜禽中具有抗病、提高生產性能、改善胴體性狀、改善肌肉品質等作用。

甜菜堿的檢測方法很多，包括光譜法、毛細管電泳法、碘量法、核磁共振法、質譜法、比色法、高效液相色譜法等（梁國華，2016）。其中離子色譜法在檢測氨基酸、有機酸等離子性化合物中有良好的應用前景，但其在檢測甜菜糖蜜中甜菜堿的含量研究鮮有報道。本研究擬建立一種離子色譜法檢測甜菜糖蜜中甜菜堿的方法，為甜菜糖蜜在畜禽養殖中的進一步應用和甜菜糖蜜質量標準研究提供一定的方法支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑 吡啶二甲酸、硝酸、超純水（實驗室自制）。

1.1.2 儀器和設備 分析天平（感量0.1 mg）；離子色譜儀（瑞士萬通850 Professional IC）；數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.1.3 標準物質 甜菜堿鹽酸鹽，純度大于98%（Sigma）。

1.1.3.1 甜菜堿標準儲備溶液 精密稱取于105℃干燥過甜菜堿鹽酸鹽標準品0.1312 g，置于10 mL容量瓶中，用超純水定容，配成標準儲備溶液，甜菜堿濃度為10.0 mg/mL，2～8℃冷藏保存，有效期為兩個月。

1.1.3.2 甜菜堿標準工作溶液 準確移取甜菜堿標準儲備溶液適量，用超純水稀釋成甜菜堿濃度分別為10、20、50、100、200、500μg/mL的標準工作溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測方式的選擇 由于甜菜堿是一種季銨型生物堿，在酸性條件下，可以電離成陽離子，在電導檢測器條件下有電導響應。因此，選擇電導檢測器作為檢測方式。

1.2.2 儀器分析條件的選擇 萬通離子色譜測定陽離子時主要選擇0.7 mmol/L吡啶二甲酸和1.7 mmol/L硝酸溶液的混合液為淋洗液進行淋洗。但是測定甜菜糖蜜樣品中甜菜堿的過程中發現，使用常規濃度的淋洗液不能將甜菜堿和其他干擾的陽離子進行有效分離，主要是因為甜菜糖蜜中含有一定量鉀、鈣、鈉、鎂、有機酸等陽離子。對不同質量濃度的吡啶二甲酸對甜菜堿與其他陽離子的分離情況進行考察，分別對不同濃度的吡啶二甲酸和硝酸溶液的淋洗效果進行了比較，結果表明，不使用吡啶二甲酸，只用1.7 mmol/L硝酸溶液作為淋洗液的淋洗效果最佳。分離效果圖譜見圖1、2。

圖1 0.7 mmol/L吡啶二甲酸和1.7 mmol/L硝酸溶液為淋洗液的分離效果

圖2 1.7 mmol/L硝酸溶液為淋洗液的分離效果

通過對色譜條件的優化，最終確定為C4陽離子分析柱（150 mm×4.6 mm，4μm）；柱溫：35℃；以1.7 mmol/L硝酸溶液為淋洗液進行淋洗，流速為0.800 mL/min；檢測器：電導檢測器；進樣體積：10μL。在上述色譜條件下，500μg/mL的標準工作溶液圖譜見圖3。

圖3 標準溶液圖譜

1.2.3 提取條件的確定 甜菜堿是一種季銨型水溶性生物堿，極易溶于水，易溶于甲醇，溶于乙醇。根據甜菜堿物理性質，提取方法大多可概括為水提取和醇提取兩種（李煒等，2006）。甜菜糖蜜是以制糖甜菜為原料制糖后得到的殘余糖漿，所以選擇水作為提取試劑。選用振蕩器振蕩、渦旋混合器混勻和超聲三種不同的方法提取，結果表明三種提取方式的回收率基本相同。考慮到成批量操作時簡便的因素，本實驗采用超聲提取25 min。

最終確定的前處理條件為精確稱取約2.5 g糖蜜樣品，置于100 mL容量瓶中，加入70 mL超純水，室溫超聲處理30 min，定容至刻度，搖勻。靜置10 min，取2 mL上清液于10 mL容量瓶中，用超純水定容到刻度。0.45μm微孔濾膜過濾后，進入離子色譜進行分析。

2 結果

2.1 標準工作溶液線性 標準工作溶液依次從低濃度到高濃度進樣，每一濃度進樣三次，以所得峰面積平均值為縱坐標，標液濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數。獲得的標準曲線具有良好的線性范圍，線性相關系數R2=1.000，標準線性方程見圖4。

圖4 標準溶液線性方程

2.2 標準溶液的重復性 用50μg/mL甜菜堿標準溶液連續進樣6次，實驗結果見表1。結果表明，同一濃度的標準溶液有較好的重復性，RSD值小于5.0%。

表1 標準溶液的重復性

表2 不同甜菜糖蜜樣品中添加甜菜堿的回收率%

2.3 方法準確度和精密度實驗 選取3個甜菜糖蜜樣品作為測試對象，進行加標回收率實驗。分別加入適宜體積的甜菜堿標準工作溶液，使其添加濃度均為1.0、5.0、20 g/kg，進行加標回收實驗，每種樣品同一濃度做5次平行實驗。結果見表2。實驗結果表明，在添加上述3個濃度的不同糖蜜樣品中，其平均回收率為87.1%～96.1%，重復性RSD最大的為4.8%，說明該方法有較高的準確性和重現性。甜菜糖蜜樣品添加回收圖譜見圖5。

圖5 甜菜糖蜜5.0 g/kg樣品添加圖譜

2.4 不同區域甜菜糖蜜樣品中甜菜堿的含量 為考察方法的適用性，收集了產自新疆、內蒙的10個批次甜菜糖蜜樣品，樣品中甜菜堿的含量見表3。分析結果表明，不同產地的糖蜜樣品中甜菜堿的含量無顯著差異，含量在3.34%～4.51%。

表3 不同甜菜糖蜜樣品中甜菜堿的含量

3 結論

本研究建立的甜菜糖蜜中甜菜堿的離子色譜檢測方法，樣品的提取步驟科學合理，易于掌握，測試數據重復性好，添加回收率均可滿足甜菜糖蜜中甜菜堿的測定要求。