山藥多糖對斷奶仔豬免疫性能和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響研究

趙偉鑫， 曹猛猛， 靳 艷， 張金洲， 苗志國

（河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng)453003）

飼料中添加抗生素可以預(yù)防和治療由斷奶壓力所引發(fā)的腸道疾病，但抗生素長期過量使用，會導致細菌產(chǎn)生多重耐藥性、畜產(chǎn)品中抗生素殘留以及肉產(chǎn)品質(zhì)量等問題（龔澤修等，2019）。因此，開發(fā)新型飼料添加劑用于替代抗生素已成為當前研究的熱點。中草藥及其提取物作為抗菌劑潛在的替代品在調(diào)節(jié)早期斷奶動物免疫性能與腸道健康方面的研究，已經(jīng)受到學者的廣泛關(guān)注（陳麗玲等，2020）。山藥是我國常見的食用和藥用食品之一，具有改善胃腸功能、緩解厭食和治療腹瀉等多種藥理作用（Liu等，2016）。山藥多糖主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖組成，是山藥中重要的活性成分之一。現(xiàn)有研究表明，山藥多糖的生物活性主要包括抗腫瘤、抗突變、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、調(diào)節(jié)胃腸等方面（Huang等，2020；陳夢雨等，2020；Ju等，2014）。此外，山藥多糖還廣泛被應(yīng)用于食品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，但山藥多糖在斷奶仔豬上的研究則鮮有報道。因此，本研究以山藥多糖為試驗材料，用于探討其對斷奶仔豬免疫性能、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)與消化酶活性的影響，旨在為有效利用山藥多糖、開發(fā)豬用綠色中草藥飼料添加劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 選擇90頭28日齡平均體重（7.60±0.14）kg的杜×長×大三元雜交斷奶仔豬，試驗仔豬由河南省沈丘縣春發(fā)養(yǎng)殖場提供。試驗豬所用基礎(chǔ)日糧依照NRC（2012）豬營養(yǎng)標準進行配制，其原料組成及營養(yǎng)水平見表1。山藥多糖購于陜西哈拿生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計 斷奶仔豬按胎次一致、體重相近、公母各半的分組方法，采用隨機分組設(shè)計，分為5組，每組3個重復，每個重復6頭。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，不添加山藥多糖；其他組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加0.01%、0.05%、0.10%、0.20%山藥多糖。試驗采用群飼，飼養(yǎng)管理按常規(guī)進行，自由采食和飲水，預(yù)試期7 d，正試期40 d。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 腸道取樣 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，隨機從每組的每個重復中選擇體重相近的健康仔豬各2頭（公母各半），共30頭，自由飲水，停食12 h。然后采用頸靜脈放血處死，打開腹腔，在每頭仔豬相同部位剪取十二指腸、空腸和回腸0.5 cm的腸道組織，放入盛有10%福爾馬林固定液的玻璃容器中，在4℃條件下保存至光學顯微鏡切片的制備和觀察。此外，在相同部位對十二指腸、空腸、回腸進行結(jié)扎，并在結(jié)扎的兩端剪斷，用酒精棉球消毒各斷口，放入消毒容器中，4℃立即運回實驗室，用于消化酶活性的分析。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 免疫性能指標測定 通過頸靜脈穿刺將10 mL血液采集到不含抗凝劑的真空管中。在4℃下放置30 min，3000 r/min離心10 min，分離血清并將其轉(zhuǎn)入0.5 mL離心管中，經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)入-20℃冰箱中分析備用。采用ELISA法酶聯(lián)免疫吸附試驗法對豬免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、白細胞介素2（IL-2）、白細胞介素6（IL-6）、干擾素γ（IFN-γ）的含量進行分析檢測，試劑盒均購自南京建成公司。

1.4.2 小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)測定 經(jīng)過高溫清洗、脫水、透明、蠟浸、包埋等處理后，將切片切成5μm的厚度，然后用蘇木精-伊紅染料染色，并用中性環(huán)氧膠固定后制成光鏡切片。拍照觀察、顯微測量小腸各段絨毛高度和隱窩深度時采用萊卡Qwin圖像分析儀，并計算絨毛高度與隱窩深度的比值。每個樣品制作3個非連續(xù)性的縱向切片，每個切片測量10個絨毛高度、隱窩深度，采用計算平均值的方法對每個數(shù)據(jù)進行測定。

1.4.3 消化酶活性的測定 胰蛋白酶、胰脂肪酶和淀粉酶的活性均采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行測定。取在屠宰試驗中分離得到的小腸內(nèi)容物，稱重后，按重量體積比1∶9加入樣本勻漿介質(zhì)，冰浴條件下充分勻漿。2500 r/min離心10 min，取上清液測定胰蛋白酶活性；取小腸內(nèi)容物，稱重后，按重量體積比1∶4加入生理鹽水介質(zhì)勻漿。4000 r/min離心10 min，取上清液用于測定胰脂肪酶和胰淀粉酶的活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理 本試驗所得數(shù)據(jù)全部采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件中的One-Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標準誤”表示，P＜0.05時確定為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥多糖對仔豬免疫性能的影響 由表2可知，在日糧中添加一定量的山藥多糖均能不同程度地提高血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-6和IFN-γ水平。與對照組相比，各試驗組的IgG分別提高了18.83%（P＞0.05）、22.87%（P＞0.05）、32.74%（P＜0.05）和21.97%（P＞0.05）；試驗組IgM分別提高了8.96%（P＞0.05）、61.19%（P＜0.05）、80.60%（P＜0.05）和76.12%（P＜0.05）；試驗組IgA分別提高了21.43%（P＞0.05）、42.86%（P＜0.05）、92.86%（P＜0.05）和50.00%（P＜0.05）。與對照組相比，試驗組的細胞因子IL-2分別顯著提高了12.43%（P＜0.05）、26.09%（P＜0.05）、32.34%（P＜0.05）和66.72%（P＜0.05）；IL-6分別提高了8.39%（P＞0.05）、32.50%（P＜0.05）、58.86%（P＜0.05）和59.34%（P＜0.05）；IFN-γ分別顯著提高了14.78%（P＜0.05）、25.50%（P＜0.05）、34.40%（P＜0.05）和28.49%（P＜0.05）。

表2 山藥多糖對仔豬免疫性能的影響

2.2 山藥多糖對斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響如表3所示，與對照組相比，0.10%、0.20%山藥多糖組十二指腸絨毛高度分別增加了14.70%（P＜0.05）、8.94%（P＜0.05）；隱窩深度分別降低了21.44%（P＜0.05）、15.79%（P＜0.05）；絨毛/隱窩分別增加了46.15%（P＜0.05）、29.55%（P＜0.05）。空腸絨毛高度分別增加了12.49%（P＜0.05）、10.71%（P＜0.05）；隱窩深度分別降低了20.17%（P＜0.05）、15.99%（P＜0.05）；絨毛/隱窩分別增加了40.96%（P＜0.05）、31.73%（P＜0.05）。回腸腸絨毛高度分別增加了9.56%（P＜0.05）、5.93%（P＜0.05）；隱窩深度分別降低了28.30%（P＜0.05）、20.99%（P＜0.05）；絨毛/隱窩分別增加了52.97%（P＜0.05）、34.16%（P＜0.05）。

表3 山藥多糖對斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.3 山藥多糖對斷奶仔豬消化酶活性的影響如表4所示，與對照組相比，0.10%、0.20%山藥多糖組十二指腸蛋白酶活性分別增加了9.55%（P＜0.05）、6.17%（P＜0.05）；淀粉酶活性分別增加了15.33%（P＜0.05）、9.75%（P＜0.05）；0.1%山藥多糖組脂肪酶活性增加了14.65%（P＜0.05）。0.1%山藥多糖組空腸中蛋白酶、淀粉酶活性分別增加了7.62%（P＜0.05）和28.54%（P＜0.05）；0.05%、0.1%、0.2%山藥多糖組回腸蛋白酶活性分別增加了7.92%（P＜0.05）、10.57%（P＜0.05）、9.06%（P＜0.05）；淀粉酶活性分別增加了16.84%（P＜0.05）、22.73%（P＜0.05）、17.27%（P＜0.05）。

表4 山藥多糖對斷奶仔豬消化酶活性的影響U/g

3 討論

研究表明，山藥多糖在一定程度上可以誘導免疫因子的產(chǎn)生，增強機體的免疫功能，起到體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)作用（Huang等，2020；秦婷等，2013）。仔豬血清中IgA、IgG、IgM在維持動物機體免疫功能方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，機體防御能力強弱可通過干擾素的含量多少進行判斷（王曉艷，2018）。另一方面，巨噬細胞能夠分泌細胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ，以及活性效應(yīng)分子NO，從而促進巨噬細胞識別抗原性異物的能力，提高巨噬細胞的吞噬功能，增強機體的抵抗力（雷金麗等，2018；Iguchi等，1996）。楊硼飛（2018）研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在動物體內(nèi)可促進內(nèi)源性干擾素的產(chǎn)生，以及抑制病毒蛋白的合成，因此使黃芪多糖能夠發(fā)揮增強機體免疫功能的效果。王蓉等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，沙棘多糖能夠增強免疫低下小鼠TNF-α、IL-6和IFN-γ的表達水平，提高免疫低下小鼠的免疫功能。Zhou等（2018）發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖能保護免疫抑制小鼠免疫器官（改善免疫器官指數(shù)，減輕免疫器官損傷），顯著提高血清IL-2、IL-12、IFN-γ和IgG水平，表明銀耳多糖具有增強免疫抑制小鼠免疫活性的作用。譚春愛（2014）分析表明，日糧中添加山藥多糖能顯著提高寧都黃雞的血液中IgA、IgG、IgM水平，進而提高免疫能力。日糧中添加酵母多糖仔豬血清中IgM含量顯著提高（張金寶等，2018；徐杰等，2018）。這些研究結(jié)果均與本試驗結(jié)果相似，說明山藥多糖能夠有效地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

動物腸道屏障結(jié)構(gòu)的完整性是保障正常消化吸收功能的重要基礎(chǔ)之一（李小蘭，2015）。當腸道屏障受損時，會影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用并導致腹瀉。仔豬的免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等方面發(fā)育不完善，斷奶時飼料形式和喂養(yǎng)條件的轉(zhuǎn)變會引起機體免疫能力的下降、腸道損傷以及消化酶活性不足等問題，從而導致仔豬發(fā)病率和死亡率等風險增加。大量研究表明，山藥多糖在維持腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性，改善腸道健康，提高機體免疫力方面發(fā)揮重要作用（龔凌霄等，2019；Zhang等，2019；于蓮等，2016）。Milm等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加一定量的山藥多糖具有調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫的潛力。陳麗玲等（2020）發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加白術(shù)茯苓多糖能有效改善小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，維持腸道正常的通透性。Rattigan等（2019）發(fā)現(xiàn)，添加巖藻糖膠可以改善斷奶仔豬腸道形態(tài)和增加消化酶活性。Liu等（2020）研究表明，食用海藻多糖可以通過改善中華絨螯蝦免疫反應(yīng)和腸道健康來提高其生長性能。這些研究結(jié)果均與本試驗結(jié)果相似，說明山藥多糖能夠有效地改善斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，添加山藥多糖可以提高仔豬血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-6和IFN-γ水平，提高腸道絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度比值和消化酶活性，降低腸道隱窩深度，本試驗條件下，0.10%山藥多糖添加效果最好。