地下水水化學組成對Fe(Ⅱ)氧化過程中錳氧化菌失活的影響

孫群群，屈婧祎，童 曼，袁松虎

(中國地質大學(武漢)生物地質與環境地質國家重點實驗室，湖北 武漢 430078)

錳(Mn)是地殼中含量第二高的過渡金屬元素，在還原性地下水中通常以Mn(Ⅱ)存在。當環境受到O擾動時，Mn(Ⅱ)會被氧化為高價錳氧化物。高價錳氧化物因其強氧化能力和強吸附能力，顯著影響著生源元素的循環、污染物的遷移轉化和微生物的厭氧代謝，在多種生物地球化學過程中具有非常重要的作用。在中性條件下，Mn(Ⅱ)的生物氧化速率比化學氧化速率快1×10倍，而錳氧化菌是驅動Mn(Ⅱ)氧化的主導因子。因此，環境中錳氧化菌的活性對錳的生物地球化學行為及其主導的其他生物地球化學過程具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 微生物菌株及其培養

錳氧化模式菌株

Pseudomonas

putida

MnB1購于美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection,ATCC),該菌株編號為23483，采用胰酪大豆胨肉湯培養基(TSB)于25℃、220 r/min條件下活化后用于后續實驗。先將活化12 h(達對數生長期后期)后的MnB1菌液以8 000 r/min的轉速離心5 min并收集菌體，再用5 mmol/L硫酸鈉溶液洗滌3次，最后將菌體重新懸濁，得到初始菌濃度約為1×10CFU/mL的菌液，按照1%的比例加入實驗體系。

1.2 實驗試劑

七水合硫酸亞鐵(FeSO·7HO，99.9%)、硫酸鈉(NaSO，99%)、硼酸(HBO，99.5%)、四硼酸鈉(NaBO·10HO，99.5%)、二水合檸檬酸鈉(NaCHO·2HO，99.5%)、草酸(HCO，99.8%)、磷酸三鈉(NaPO·12HO，98%)、氯化鎂(MgCl·6HO，99%)、氯化鈣(CaCl·2HO，99%)均購于中國國藥控股股份有限公司，胰酪大豆胨肉湯培養基(TSB)購于美國BD公司，腐殖酸(HA，C含量為34.2%，N含量為0.75%，S含量為0.30%)購于Sigma Aldrich公司，2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid(MES，99%)購于美國Biosharp公司。其他試驗試劑均為分析純或更高純度級別的試劑。

1.3 實驗方法

1.4 分析方法

(1) 利用平板涂布法計量MnB1菌株活菌數量。在不同反應時間點各取100 μL樣品，逐級連續稀釋至適當濃度后，取100 μL稀釋后的樣品涂布在固體TSB培養基上，每個樣品按2～3個濃度梯度進行涂布；涂布后，將培養皿放置于30℃恒溫培養箱中培養，待培養基表面長出明顯菌落后，對菌落數目進行計數。

(2) 利用鄰菲咯啉顯色法測定溶解態Fe(Ⅱ)濃度。在不同反應時間點各取1.5 mL樣品，用0.22 μm濾膜過濾至5 μL濃度為6 mol/L HCl中，混勻后取400 μL混合液至160 μL的0.5%鄰菲羅啉溶液中，顯色10 min，加入1 mL乙酸-乙酸銨緩沖液，用去離子水定容至4 mL，搖勻后在510 nm波長下測量吸光度，根據Fe(Ⅱ)的標準曲線換算出溶解態Fe(Ⅱ)濃度。

2 結果與討論

2.1 pH值對MnB1菌株失活的影響

不同pH值條件下，Fe(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株活菌數量和Fe(Ⅱ)濃度的變化曲線，見圖1。

圖1 pH值對MnB1菌株活性和溶解態Fe(Ⅱ)氧化的影響Fig.1 Change curves of MnB1 activity and Fe(Ⅱ) concentration upon Fe(Ⅱ) oxygenation under different pH values注：N0和Nt分別為初始和t時刻MnB1菌株的濃度(CFU/mL),其中N0=1×107CFU/mL；C0和Ct分別為初始和t時刻溶解態Fe(Ⅱ)的濃度(mmol/L),其中C0=0.2 mmol/L。

由圖1可見，在不同pH值條件下，Fe(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株活菌數量均大量減少。MnB1菌株的失活主要是由以下兩個機制引起的：①Fe(Ⅱ)活化O過程中生成的ROS通過損傷DNA、蛋白質和脂質造成細菌失活；②Fe(Ⅱ)氧化生成的鐵(氫)氧化物沉淀包被在細胞表面，通過破壞細胞膜的通透性引起細菌失活。此外，由圖1(a)可見，不同pH值條件下MnB1菌株的失活速率存在顯著差異：當pH值為7.0時，Fe(Ⅱ)氧化5 min即使MnB1菌株活菌數量降低了4.3個數量級(lg)；而當pH值為6.6時，反應60 min時MnB1菌株活菌數量下降了4個數量級(lg)。由圖1(b)可見，pH值為7.0的實驗體系中Fe(Ⅱ)的氧化速率遠高于pH值為6.6的實驗體系，說明MnB1菌株的失活速率與Fe(Ⅱ)的氧化速率密切相關。另外，pH值為7.0的實驗體系中反應60 min時Fe(Ⅱ)幾乎全部被氧化，而pH值為6.6的實驗體系中反應至60 min時僅有17%的Fe(Ⅱ)被氧化，此時pH值為7.0的實驗體系中鐵(氫)氧化物的含量遠高于pH值為6.6的實驗體系。然而，最終兩個實驗體系中MnB1菌株的失活數量相差并不大，即單位Fe(Ⅱ)氧化量下pH值為6.6的實驗體系中MnB1菌株的失活率更高，這是由于pH值的降低能夠顯著促進Fe(Ⅱ)氧化過程中羥基自由基(·OH)的產生，見圖2。

圖2 pH值對實驗體系中·OH產生量的影響Fig.2 Effect of pH on ·OH production

由圖2可見，當pH值由7.0降為6.6時，反應60 min后實驗體系中·OH的累積濃度由1.6 μmol/L增加至3.7 μmol/L，因此使得pH值為6.6的實驗體系中因·OH的產生造成失活的MnB1菌株數量更多。

2.2 天然有機質對MnB1菌株失活的影響

在pH值為7.0的條件下，本實驗考察了檸檬酸鈉、草酸和腐殖酸3種天然有機質對MnB1菌株活性和溶解態Fe(Ⅱ)氧化的影響，其實驗結果見圖3。

由圖3可見，3種有機質均抑制了Fe(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株的失活，且草酸和腐殖酸對Fe(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株失活的抑制率遠高于檸檬酸鈉；反應60 min時，5～20 mg/L檸檬酸鈉對MnB1菌株失活的抑制率為16.6%～30.3%[見圖3(a)]，5～20 mg/L草酸對MnB1菌株失活的抑制率為 64.3%～68.7%[見圖3(b)],10～30 mg/L腐殖酸對MnB1菌株失活的抑制率為63.6%～73.4%[見圖3(c)]。

圖3 3種天然有機質對MnB1菌株活性和溶解態Fe(Ⅱ)氧化的影響Fig.3 Change curves of MnB1 activity and Fe(Ⅱ) concentration upon Fe(Ⅱ) oxygenation under three different natural organic matters conditons

天然有機質對Fe(Ⅱ)氧化過程中細菌的失活有兩種相反的作用:一方面，天然有機質可通過與Fe(Ⅱ)發生配位絡合作用，從而促進了Fe(Ⅱ)的氧化和ROS的產生，如加入10 mg/L檸檬酸鈉、10 mg/L草酸和10 mg/L腐殖酸反應60 min后實驗體系中·OH的累積濃度由1.6 μmol/L分別增加至1.7 μmol/L、2.3 μmol/L和3.5 μmol/L，該機制會促進細菌的失活[見圖4(a)];另一方面，天然有機質可能與Fe(Ⅲ)發生配位絡合作用，從而抑制鐵(氫)氧化物沉淀的生成，該機制會抑制Fe(Ⅱ)氧化過程中細菌的失活，即加入3種天然有機質后促進了反應體系中水相Fe(Ⅲ)的產生，從而抑制了鐵(氫)氧化物沉淀的生成，且腐殖酸和草酸對鐵(氫)氧化物沉淀的抑制作用明顯高于檸檬酸。該研究結果表明，天然有機質對鐵(氫)氧化物沉淀的抑制作用在本實驗體系中占主導地位，由此導致了天然有機質實驗體系中MnB1菌株失活率的降低。

圖4 不同天然有機質種類對·OH累積濃度、水相Fe(Ⅲ)濃度和固相Fe(Ⅲ)濃度的影響Fig.4 Effect of natural organic matters on the production of ·OH,aqueous Fe(Ⅲ) and solid Fe(Ⅲ)

2.3 陰陽離子對MnB1菌株失活的影響

圖5 不同P、Mg2+和Ca2+濃度對MnB1菌株活性和溶解態Fe(Ⅱ)氧化的影響Fig.5 Change curves of MnB1 activity and dissolved Fe(Ⅱ) concentration upon Fe(Ⅱ) oxygenation under different concentrations of P,Mg2+ and Ca2+

由圖5(b)、(c)可見，Mg、Ca的加入明顯抑制了Fe(Ⅱ)氧化過程中MnB1菌株的失活，反應60 min時，1 mmol/L、3 mmol/L和6 mmol/L的Mg對MnB1菌株失活的抑制率分別為52.7%、54.2%和70.2%，1 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L的Ca對MnB1菌株失活的抑制率分別為49.0%、53.8%和66.5%。Mg、Ca對Fe(Ⅱ)氧化過程中·OH的產生量無明顯影響。

Mg、Ca的加入使實驗體系中的pH值由7.0最終降為6.6(見圖6)。由圖1(a)可知，當pH值由7.0降為6.6，反應60 min時，MnB1菌株的失活量僅緩解了約0.3個數量級(lg)，而加入Mg和Ca后實驗體系中MnB1菌株的失活量被緩解了約2.5個數量級(lg)，遠高于0.3個數量級(lg)，這表明實驗體系pH值的降低只是Mg和Ca抑制MnB1菌株失活的次要因素。Cl與·OH的反應常數達4.3×10[mol/(L·s)]，且有研究表明Cl因消耗反應體系中的·OH進而抑制了活性氧物質對污染物的降解,因此Cl可通過競爭·OH進而抑制MnB1菌株的失活，該過程是抑制MnB1菌株失活的主要因素。

圖6 Mg2+、Ca2+體系中pH值的變化Fig.6 pH variations in the presence of Mg2+ and Ca2+

2.4 環境意義

3 結 論

(1) pH值為7.0的實驗體系通過促進Fe(Ⅱ)的氧化速率提高了MnB1菌株的失活總量，但pH值為6.6的實驗體系中由于促進了·OH的產生進而導致單位Fe(Ⅱ)氧化量下MnB1菌株的失活率更高。

(2) 檸檬酸鈉、草酸和腐殖酸均通過阻止鐵(氫)氧化物沉淀的生成來抑制實驗體系中MnB1菌株的失活。其中，草酸和腐殖酸的抑制作用大于檸檬酸鈉，其原因為前兩者對鐵(氫)氧化物沉淀生成的抑制作用更強。