EGCG-Cu對(duì)水中大腸桿菌的殺滅性能研究

冉強(qiáng)三，金紀(jì)玥，馮萃敏，郭子玉，李敬一，陳梓怡

(1.北京建筑大學(xué) 城市雨水系統(tǒng)與水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044；2.北京建筑大學(xué) 水環(huán)境國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 100044；3.北京市自來水集團(tuán)有限公司，北京 100031；4.北京市市政工程設(shè)計(jì)研究總院有限公司，北京 100082)

目前常用的飲用水消毒方式有氯消毒、臭氧消毒、紫外線消毒等[1]，但氯在消毒過程中會(huì)產(chǎn)生氯化消毒副產(chǎn)物[2-5]，臭氧和紫外線無持續(xù)消毒殺菌能力，無法保證飲用水的安全性[6-7]。進(jìn)入21世紀(jì)后，飲用水的安全標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步提升，目標(biāo)是發(fā)展更加綠色高效的飲用水消毒技術(shù)[8]。

茶多酚是一種新型、綠色、環(huán)保植物制劑[9-10]，大量研究表明，茶多酚除了有抗氧化性、抗老化、調(diào)血脂、抗腫瘤等作用外[11-14]，還具有強(qiáng)效的廣譜抑菌性[15-16]，具備良好的消毒效果且持續(xù)時(shí)間較久，其綠色、高效的特性使之可成為一種新型的飲用水輔助消毒劑或天然水源應(yīng)急消毒劑[17]。

茶多酚作為輔助消毒劑與管道釋放的金屬離子可能發(fā)生反應(yīng)，因此，選擇茶多酚中含量最多且在消毒過程中起主要作用的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，使其與抗菌元素銅離子絡(luò)合，制備EGCG-Cu絡(luò)合物，研究EGCG-Cu絡(luò)合物的抑菌能力與抑菌機(jī)理，以促進(jìn)茶多酚及其絡(luò)合物在水消毒中的推廣應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

EGCG，生物制品；硫酸銅、碳酸氫鈉、乙醇均為分析純；大腸桿菌，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心生產(chǎn)(編號(hào)10004)；用作大腸桿菌計(jì)數(shù)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(二級(jí)品)，由6.6 g營養(yǎng)瓊脂粉、200 mL蒸餾水溶解、加熱滅菌而得；用作大腸桿菌復(fù)蘇培養(yǎng)的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(二級(jí)品)，由3.6 g肉湯培養(yǎng)基、200 mL蒸餾水溶解加熱滅菌而得；溶解藥劑與配制菌液的用水為蒸餾水。

DR6000紫外分光光度計(jì)；RT-6100酶標(biāo)儀；DYCP-33A電泳槽。

1.2 EGCG-Cu制備

采用水熱法由EGCG和硫酸銅溶液制備。EGCG 0.5 mmol用30 mL蒸餾水溶解，將1 mmol的硫酸銅配制成溶液后逐滴加入EGCG溶液中，混勻。用1 mol/L的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)溶液pH至7，在40 ℃下用恒溫磁力攪拌器攪拌1 h，使其充分絡(luò)合。沉淀用1∶1乙醇-水溶液洗滌，真空冷凍干燥12 h，得EGCG-Cu。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液制備 用無菌接種環(huán)沾取大腸桿菌，溶解后放入培養(yǎng)基中恒溫恒壓培養(yǎng)，得處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的菌懸液，菌數(shù)為106～108CFU/mL。可用無菌生理鹽水稀釋待用。

1.3.2 最低抑菌濃度(MIC) 對(duì)104數(shù)量級(jí)的大腸桿菌菌懸液，配制一系列濃度的EGCG和EGCG-Cu溶液進(jìn)行MIC實(shí)驗(yàn)。

在無菌條件下，將營養(yǎng)瓊脂分裝在兩組培養(yǎng)皿中，將大腸桿菌菌懸液稀釋到104數(shù)量級(jí)，一組控制EGCG-Cu絡(luò)合物溶液濃度分別為0，12.5，25，50，100，200，400 mg/L，另一組控制EGCG溶液濃度分別為0，125，250，500，1 000，2 000，4 000 mg/L。取100 μL的菌液涂于培養(yǎng)皿上，于37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)24 h，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效應(yīng) 1～6#錐形瓶分別加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和EGCG-Cu溶液，使EGCG-Cu濃度分別為0，10，20，30，40， 50 mg/mL。再向2～6#錐形瓶中分別加入5 mL大腸桿菌菌懸液，1#錐形瓶加入等體積生理鹽水。設(shè)定恒溫?fù)u床為37 ℃、180 r/min，定時(shí)取樣檢測(cè)OD500值，并繪制大腸桿菌生長(zhǎng)曲線圖。

1.3.4 EGCG-Cu誘導(dǎo)大腸桿菌ROS的產(chǎn)生情況 采用活性氧酶聯(lián)免疫分析試劑盒，用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定胞內(nèi)活性氧簇(ROS)。

1.3.5 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響 取4組斜面保存的細(xì)菌溶于液體培養(yǎng)基，并經(jīng)恒溫?fù)u床于37 ℃活化，用生理鹽水稀釋至 103CFU/mL 數(shù)量級(jí)，分別加入EGCG-Cu配成濃度為100，50，25，0 mg/L的混合溶液，在不同的接觸時(shí)間(0，1，3，6，24，48 h)取樣，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌遺傳物質(zhì)的影響 大腸桿菌經(jīng)恒溫?fù)u床活化后分為三組，第一組加入EGCG，第二組加入EGCG-Cu，投加量分別為其最低抑菌濃度，第三組不做處理，作為空白對(duì)照。從三組大腸桿菌提取DNA做凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 EGCG和EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度

菌落生長(zhǎng)情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 菌落生長(zhǎng)情況

由表1可知，當(dāng)大腸桿菌為104數(shù)量級(jí)時(shí)，EGCG-Cu與EGCG的MIC濃度分別為200，1 000 mg/L。表明EGCG-Cu的抑菌效果明顯比EGCG好。其原因可能是金屬Cu離子與EGCG絡(luò)合，提高了EGCG的脂溶性，使其與大腸桿菌細(xì)胞膜更容易融合，提高了抑菌效果，從而降低了最低抑菌濃度[18]。

2.2 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)

定時(shí)檢測(cè)OD500值，并繪制大腸桿菌生長(zhǎng)曲線，見圖1。

圖1 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，空白組大腸桿菌在48 h內(nèi)表現(xiàn)出明顯的調(diào)整期、指數(shù)期和穩(wěn)定期；EGCG-Cu的投加使大腸桿菌的生長(zhǎng)周期曲線受到顯著影響。EGCG-Cu濃度的增加，使指數(shù)期推遲更多，且使大腸桿菌菌體細(xì)胞密度下降更多。當(dāng)EGCG-Cu投加量>30 mg/L 后，調(diào)整期>5 h，指數(shù)期的斜率明顯變緩，并且調(diào)整期與指數(shù)期不再有清晰界限；當(dāng)EGCG-Cu濃度為50 mg/L時(shí)，大腸桿菌在24 h內(nèi)始終處于調(diào)整期，且并未出現(xiàn)明顯的指數(shù)期。

2.3 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌中活性氧的影響

當(dāng)生物體在受到消毒劑的刺激后，其自身的損傷與氧化應(yīng)激效應(yīng)將發(fā)揮作用。氧化應(yīng)激是在由于體內(nèi)產(chǎn)生了較高濃度的活性氧化自由基(ROS)，而體內(nèi)抗氧化能力不足，導(dǎo)致ROS相對(duì)增加，從而導(dǎo)致了細(xì)胞或者組織受到損傷。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，計(jì)算出ROS值[19]，結(jié)果見圖2。

裝配式結(jié)構(gòu)工程仍處于探索階段，其設(shè)計(jì)形式和施工方法各不相同，結(jié)構(gòu)形式和施工方法也不同。有必要盡早改進(jìn)施工過程，突出制造結(jié)構(gòu)的優(yōu)越性。只有在施工過程中，通過不斷的探索，實(shí)施精細(xì)化施工，完善施工管理，尤其是要通過認(rèn)真細(xì)致的質(zhì)量監(jiān)理，對(duì)工程質(zhì)量從構(gòu)件進(jìn)場(chǎng)到安裝完成的各個(gè)施工環(huán)節(jié)通過實(shí)施檢查、驗(yàn)收、巡視、跟蹤和監(jiān)理，并及時(shí)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，調(diào)整策略予以應(yīng)對(duì)，才能使工程的施工質(zhì)量得以不斷地完善和提高。

圖2 大腸桿菌胞內(nèi)ROS的變化

由圖2可知，未投加消毒劑的空白組與對(duì)照組相比，大腸桿菌胞內(nèi)的ROS值始終保持較低的濃度，且基本沒有發(fā)生變化。在EGCG組中，大腸桿菌與其接觸2 h后，在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)出較高濃度的ROS值，為28.63 IU/mL。從大量的研究可知，茶多酚在低濃度時(shí)具有較好的抗氧化性，而在高濃度時(shí)能促進(jìn)氧化作用，而在本實(shí)驗(yàn)中，投加的濃度為 1 mg/mL；在接觸6 h后，ROS值變化不大，可能是投加的EGCG濃度不高，并沒有完全殺滅大腸桿菌。在EGCG-Cu組中，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的ROS值隨著時(shí)間的變化，越來越大，是因?yàn)榻j(luò)合物中的銅元素也促進(jìn)了氧化作用。

2.4 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響

蛋白質(zhì)是大腸桿菌最重要的組成部分之一，當(dāng)胞內(nèi)蛋白流失時(shí)，必將造成整個(gè)細(xì)胞的死亡。因此，培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)濃度可作為判斷大腸桿菌細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)，進(jìn)而根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè)結(jié)果，可判斷EGCG-Cu殺滅大腸桿菌的途徑。不同濃度EGCG-Cu與大腸桿菌接觸一定時(shí)間后，培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè)結(jié)果見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)濃度變化曲線

由圖3可知，投加EGCG-Cu的大腸桿菌溶液中蛋白質(zhì)的含量比空白組有明顯增加，且EGCG-Cu濃度越高，各時(shí)刻大腸桿菌溶液中蛋白質(zhì)的含量越高，表明EGCG-Cu投量越高，對(duì)細(xì)胞膜的破壞率越大。同時(shí)，EGCG-Cu濃度越高，大腸桿菌溶液中蛋白質(zhì)含量隨接觸時(shí)間而增加，其增加速率也越大，表明EGCG-Cu投量越高，對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用越迅速，破壞速率越大。證明EGCG-Cu的投加，使大腸桿菌細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，導(dǎo)致菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的泄露，且這種破壞與EGCG-Cu的投加量和接觸時(shí)間息息相關(guān)。

2.5 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌遺傳物質(zhì)的影響

根據(jù)2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測(cè)試組加入EGCG濃度為1 000 mg/L，EGCG-Cu濃度為200 mg/L，提取EGCG處理組和EGCG-Cu處理組大腸桿菌的DNA，進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖4。

圖4 DNA電泳圖

3 結(jié)論

(1)通過水熱法合成EGCG-Cu絡(luò)合物，探究了EGCG-Cu對(duì)細(xì)菌的殺滅性能。EGCG的MIC濃度為1 000 mg/L，EGCG-Cu為200 mg/L，表明EGCG-Cu的抑菌效果優(yōu)于EGCG，相同抑菌效果所需EGCG-Cu的濃度遠(yuǎn)低于EGCG。

(2)增大EGCG-Cu濃度，將使水中大腸桿菌菌體密度降低，EGCG-Cu濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)，大腸桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段幾乎消失。EGCG-Cu殺滅大腸桿菌作用的重要體現(xiàn)是對(duì)細(xì)胞膜的破壞，并不是直接作用在其基因組。