紫草油有效成分的高效液相色譜測定法及其在超臨界流體萃取制備紫草油中的應用

沈 潔, 沈 煒, 蔡 雪, 王京霞, 鄭敏霞*

(1. 浙江中醫藥大學附屬第一醫院, 浙江 杭州 310006; 2. 浙江工業大學分析測試中心, 浙江 杭州 310014)

紫草(Lithospermum erythrorhizon)是皮膚科常用的中藥之一,具有涼血、活血、解毒透疹的功效。《本草綱目》記載:“紫草治斑疹、痘毒,活血涼血,利大腸”,用于血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、濕疹、水火燙傷等。由紫草提取制備成的紫草油能夠預防及治療嬰兒尿布疹、皮膚潰爛、濕疹等多種皮膚疾患,臨床應用非常廣泛[1]。

紫草主要的活性成分是萘醌類化合物,包括紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、β,β-二甲基丙烯酰紫草素(β,β-dimethylacrylshikonin)等成分[2],傳統的提取紫草有效成分的方法主要包括有機溶劑萃取法、水蒸氣蒸餾法、減壓蒸餾法、油浸法等,其工藝復雜,產品純度不高,常用的有機溶劑提取法提取物中常含有微量有機溶劑殘留。超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction, SFE)是近幾十年發展起來的一種新型提取技術,對許多物質有較好的滲透性和較強的溶解能力,且萃取物無溶劑殘留,保證產品100%的純天然性。梁瑞紅等[3]對新疆紫草進行了超臨界流體萃取工藝研究并與有機溶劑萃取的結果進行了比較,超臨界流體萃取比有機溶劑萃取能得到更多紫草萘醌類組分,且超臨界流體萃取所含的雜質更少,超臨界流體萃取可作為紫草有效成分提取的優選方法。目前國內外文獻報道超臨界提取紫草的研究所涉及的內容主要有紫草有效成分的分離、純化研究[4]、CO2超臨界流體萃取紫草有效成分的穩定性研究[5]、超臨界流體萃取紫草的有效成分的抗氧化研究[6]等。尚未見高效液相色譜同時測定紫草油中多種有效成分含量及用于超臨界流體萃取制備紫草油工藝優化的研究報道,還沒有形成一套嚴謹規范的工藝流程。調研國內外關于紫草有效成分檢測的文獻報道,大多是對左旋紫草素[7-10]、β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧[7-9]、乙酰紫草素[9,10]、β-乙酰氧基異戊酰紫草素[10]、β,β-二甲基丙烯酰紫草素[10]、蒽醌類[11]2到3種有效成分的含量檢測或指紋圖譜研究。

本研究建立了紫草油6種有效成分含量檢測的分析方法,并以紫草油所含的有效成分含量為評價指標,優化紫草超臨界流體萃取制備過程中的萃取壓力、萃取溫度和CO2流量3個制備工藝條件,確定了紫草超臨界流體萃取的最佳工藝流程,從而保證有效成分含量的穩定性和紫草油質量的可靠性,達到安全、有效用藥的目的。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

Waters 2695高效液相色譜系統(Waters, USA),配四元梯度泵、在線脫氣機、Waters 2996二極管陣列檢測器(PDA)、Chem Station工作站控制系統;KQ-100DA型數控超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司); EL204電子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司); MinispanPlus臺式高速離心機(杭州奧盛儀器有限公司); Milli-Q超純水系統(Millipore, USA)等。

紫草素(純度>99.0%)、乙酰紫草素(純度>99.0%)、β,β-二甲基丙烯酰紫草素(純度>99.0%)標準品購自國家標準物質中心,β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧(純度>98.0%)、異丁酰紫草素(純度>98.0%)標準品購自上海源葉生物科技有限公司,2-甲基丁酰基紫草素(純度>98.0%)標準品購于上海阿拉丁生化科技有限公司;甲酸(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乙腈(色譜純,德國默克公司);甲酸銨(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);Milli-Q超純水。

新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst由浙江中醫藥大學中藥飲片廠提供,由浙江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房鄭敏霞主任中藥師鑒定。

1.2 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流動相:含0.1%甲酸的乙腈-含5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液(75∶25, v/v),等度洗脫,流速為1 mL/min;進樣量為15 μL;柱溫為室溫;檢測波長為275 nm。

1.3 標準溶液制備

精密稱取6種紫草素標準品適量,用乙腈-水溶液(75∶25, v/v)溶解,并定容于10 mL容量瓶中,配制成混合標準品儲備液,于4 ℃避光保存。儲備液中紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素、2-甲基丁酰基紫草素的質量濃度分別為100、500、400、600、500、1 000 μg/L。

分別精密吸取儲備液適量,并稀釋成系列濃度的標準溶液,各標準系列質量濃度如下:紫草素10、20、30、40、50 μg/L,乙酰紫草素50、100、150、200、250 μg/L,β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧40、80、120、160、200 μg/L,異丁酰紫草素60、120、180、240、300 μg/L,β,β-二甲基丙烯酰紫草素0、100、150、200、250 μg/L, 2-甲基丁酰基紫草素100、200、300、400、500 μg/L。

1.4 供試品溶液制備

取紫草超臨界流體萃取所得的樣品1 mg,精密稱定,溶于1 mL乙腈-水(75∶25, v/v)溶液中,超聲1 min,用0.45 μm濾膜過濾,濾液作為供試品溶液,供分析用。

1.5 超臨界流體萃取制備紫草油

選取新疆紫草,碾碎,粗粉碎物料過篩。紫草裝料量250 g, CO2超臨界流體萃取時間2 h,無夾帶劑,一級分離,萃取壓力23 MPa,萃取溫度40 ℃, CO2流量27 L/h。

2 結果和討論

2.1 HPLC方法的建立

2.1.1有效成分檢測波長的選擇

《中國藥典》記載紫草有效成分的檢測波長為516 nm和275 nm[7],部分文獻報道紫草有效成分的檢測波長為516 nm[11],我們對紫草油的6種有效成分進行了光譜掃描,結果如圖1所示,可以看出在275 nm和516 nm處,紫草油的6種有效成分均有較高的吸收度,但在275 nm處,6種有效成分的吸收度更高,因此選擇275 nm作為檢測波長。

圖 1 紫草油中6種有效成分的PAD光譜圖Fig. 1 Spectra of six active components in lithospermum oil with photodiode array detector (PAD)

2.1.2HPLC流動相的優化

色譜條件優化過程中,對流動相溶劑(甲醇、乙腈)、流動相酸度(0.25%、0.05%、0.1%、0.2%)和流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)進行了考察。結果發現,乙腈對紫草油有效成分的洗脫能力強于甲醇,使得分離時間明顯縮短,而且分離效果也比較好;流動相的酸度對紫草油有效成分的分離度有一定的影響,隨著酸度的增大,色譜峰的峰形得到改善,但是考慮到過高的酸度可能對色譜柱的使用壽命產生影響,所以最終選擇酸度為0.1%;流動相流速選擇1.0 mL/min最為適合。色譜條件優化后的紫草油標準品和樣品色譜圖見圖2。

圖 2 優化條件下紫草油標準品和樣品的HPLC譜圖Fig. 2 HPLC profiles of lithospermum oil standards and samples under optimized chromatographic conditions 1. shikonin; 2. acetylshikonin; 3. β-acetoxyisovaleryl akanin; 4. isobutyryl shikonin; 5. β,β-dimethylacryl shikonin; 6. 2-methylbutyryl.

2.2 HPLC方法學考察

采用優化后的液相色譜條件,進樣分析一系列濃度的混合標準溶液,以峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得到線性回歸方程,如表1所示,線性關系良好。信噪比(S/N)=3的進樣質量濃度即檢出限(LOD),S/N=10的進樣質量濃度即定量限(LOQ),結果如表1所示,方法靈敏度高。

表 1 6種有效成分的線性關系、檢出限和定量限(n=3)

配制1份混合標準溶液,混合標準溶液中紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素、2-甲基丁酰基紫草素質量濃度分別為30、150、120、180、150、300 μg/L,同一天內取樣6次進樣分析,計算日內精密度;配制1份混合標準溶液,混合標準品中各成分紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素、2-甲基丁酰基紫草素質量濃度分別為40、200、160、240、200、400 μg/L,連續6日每日進樣分析,計算日間精密度,結果如表2所示,精密度良好。

表 2 日內和日間精密度試驗結果(n=6)

按供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液進樣分析評估重復性,結果見表3。按供試品溶液制備方法制備1份供試品溶液,分別于0、2、4、8、16、24 h進樣分析評估穩定性,結果見表3。

表 3 重復性和穩定性試驗結果(n=6)

按加樣回收率測定方法,分別在已知含量的樣品中,加入一定質量濃度的混合標準溶液,按照供試品溶液制備方法制備供試品6份,進樣分析,計算加樣回收率,結果見表4。

表 4 HPLC分析方法的加樣回收率結果(n=6)

以上結果證明該分析方法的重復性、穩定性和準確度良好。此分析方法可用于紫草油中6種有效成分的定量分析,有效成分的含量指標可應用于評價超臨界流體萃取制備紫草油工藝的優化過程。

2.3 超臨界流體萃取制備紫草油的工藝條件篩選

選取新疆紫草,碾碎,粗粉碎物料過篩。每組實驗裝料量250 g, CO2超臨界流體萃取時間2 h,無夾帶劑,一級分離,采用三因素三水平正交試驗法,正交試驗因素水平見表5,實驗組別見表6,考察萃取壓力、萃取溫度和CO2流量對紫草有效成分含量的影響。9組試驗所得的紫草油樣品通過上述已建立的HPLC分析方法檢測有效成分含量,有效成分含量結果見表7,HPLC譜圖見圖3。

表 5 正交試驗因素水平表

表 6 超臨界流體萃取制備紫草油工藝優化的正交試驗表

表 7 9組超臨界流體萃取工藝制備所得紫草油的有效

圖 3 9組超臨界流體萃取工藝制備所得紫草油的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of lithospermum oil prepared by nine supercritical extraction processes Samples S1-S9: obtained from Tests 1-9 in Table 6. 1. shikonin; 2. acetylshikonin; 3. β-acetoxyisovaleryl akanin; 4. isobutyryl shikonin; 5. β,β-dimethylacryl shikonin; 6. 2-methylbutyryl.

影響超臨界流體萃取有效成分的主要因素有萃取壓力、萃取溫度和CO2流量,本實驗采用三因素三水平正交試驗法來優化紫草超臨界流體萃取的工藝條件,結果發現試驗1至試驗9所得的紫草油有效成分的總量分別是S1=562.59 μg/L, S2=604.64 μg/L, S3=818.74 μg/L, S4=738.42 μg/L, S5=909.84 μg/L, S6=977.84 μg/L, S7=880.54 μg/L, S8=713.61 μg/L, S9=809.54 μg/L。試驗6的工藝條件所得的紫草油有效成分含量最高,且試驗6所需的CO2流量最少,符合工業化大生產的需求。所以超臨界流體萃取制備紫草油的最優工藝條件是:萃取壓力23 MPa,萃取溫度40 ℃, CO2流量27 L/h。

3 結論

本研究建立了HPLC-PAD法同時測定紫草油中6種有效成分含量的分析方法,并將此方法應用于超臨界流體萃取制備紫草油的工藝優化過程,優化后的工藝條件能夠滿足紫草油制備需求,有效成分含量穩定。本方法簡便可行、準確可靠,可用于超臨界流體萃取制備紫草油的工藝過程和質量控制。