高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測血液中3種季銨鹽類肌松劑

黃永鵬, 唐 慧, 宋云揚, 陳 博, 鐘 輝

(國民核生化災害防護國家重點實驗室, 北京 102205)

維庫溴銨(vecuronium bromide)、羅庫溴銨(rocuronium bromide)和泮庫溴銨(pancuronium bromide)是甾類非去極化肌松劑,與其他非去極化肌松劑相比,具有起效作用快、作用時間長、體內無積聚、安全性高等優點,被廣泛應用于氣管插管和外科手術中[1-4]。但在使用過程中,該類肌肉松弛劑可引起紅斑疹、惡心、嘔吐、頭暈等過敏反應，甚至死亡[5-8],建立快速定量分析該類肌松劑的方法，對臨床診斷、產品質量控制和安全用藥等均有重要應用價值。

維庫溴銨、羅庫溴銨和泮庫溴銨均是季銨鹽結構,為強極性水溶性化合物,在反相色譜柱上難以保留,多采用離子對色譜法進行分離。目前,檢測季銨鹽類肌松劑的方法主要有液相色譜法(HPLC)[9-15]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[16-21]和毛細管電泳法(CZE)[20,21]等。其中,HPLC不適于痕量檢測,其流動相主要為離子對試劑,流動相組成相對復雜,不同文獻報道的流動相組成也有所不同。離子對試劑有離子抑制作用,會降低質譜檢測的靈敏度,無法將應用于HPLC的流動相直接應用于LC-MS/MS。已報道的檢測肌松劑的LC-MS/MS也存在一些不足,如加標回收率范圍較寬[22]、檢出限較高[23]、測定時間較長[24]等。

本文采用HPLC-MS/MS對血液中3種季銨鹽類肌松劑進行了定量分析。血液樣品經稀釋、離心和固相萃取柱凈化,經色譜柱分離后進入質譜檢測。該方法前處理簡便,測定時間短,檢出限低,回收率較好,能夠滿足血液樣品中3種季銨鹽類肌松劑同時檢測的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1200-6410 Triple Quad高效液相色譜-質譜聯用儀、0.45 μm微孔濾膜(美國Agilent公司); Bond Elut AL-N固相萃取柱(60 mg,美國Varian公司); XP105天平(上海Mettler-Toledo公司)。

乙腈(HPLC級,德國Merk KGaA公司);甲酸、三氟乙酸和乙酸銨(分析純,上海Macklin Biochemical公司);維庫溴銨、羅庫溴銨和泮庫溴銨(純度均>95%,北京百靈威科技有限公司);實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備溶液:分別準確稱取適量的維庫溴銨、羅庫溴銨和泮庫溴銨樣品,用乙腈溶解并定容,配制成1 mg/mL的標準儲備液,室溫避光保存。

標準工作溶液:分別取上述標準儲備溶液適量,用乙腈定容至10 mL,配制成已知濃度的混合標準工作溶液,室溫避光保存。

1.3 樣品前處理

取血液樣品0.5 mL,加入甲酸-水-乙腈(2∶48∶50, v/v/v)溶液4 mL,振蕩均勻,以5 000 r/min離心30 min,取上清液過Bond Elut AL-N固相萃取柱(先用3 mL甲酸-水-乙腈(2∶48∶50, v/v/v)溶液活化),精密吸取3 mL甲酸-水-乙腈(2∶48∶50, v/v/v)洗脫目標物,并用0.45 μm的微孔濾膜過濾,待用。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:ZIC-cHILIC柱(50 mm×2.1 mm, 3.0 μm,德國Merck KGaA公司);柱溫:30 ℃;流動相A:乙腈;流動相B: 0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序:0～0.8 min, 70%A; 0.8～0.9 min, 70%A～50%A; 0.9～1.3 min, 50%A～40%A; 1.3～1.4 min, 40%A; 1.4～1.8 min, 40%A～10%A; 1.8～1.9 min, 10%A～70%A; 1.9～3.0 min, 70%A。進樣量5 μL。

1.4.2質譜條件

電噴霧電離(ESI)源,正離子掃描模式;毛細管電壓4 000 V;脫溶劑氣溫度300 ℃;脫溶劑氣流量8 L/min;多反應監測(MRM)模式。各待測物的定性及定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量等參數見表1。

表 1 3種肌松劑的質譜參數

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

取1.0 μg/mL 3種目標物的標準溶液,分別以自動進樣的方式在ESI+模式下進行質譜條件優化,3種目標物全掃描質譜圖見圖1。結果表明,單電荷離子結構的維庫溴銨和羅庫溴銨均會產生[M-Br-]+和[M-Br-+H]2+,其m/z分別為557.4、279.2和529.4、265.2,雙電荷離子結構的泮庫溴銨則產生m/z為286.6的[M-2Br-]2+。最優錐孔電壓下,維庫溴銨和羅庫溴銨[M-Br-+H]2+的豐度均高于[M-Br-]+的豐度,故選用維庫溴銨和羅庫溴銨[M-Br-+H]2+、泮庫溴銨[M-2Br-]2+為母離子進行二級質譜條件優化。通過子離子掃描得到目標物碎片離子信息,并對碰撞能量進行優化,每個目標物以響應最高的分子離子對作為定量離子對，響應次高的分子離子對作為定性離子對(見表1)。

圖 1 3種肌松劑的全掃描質譜圖Fig. 1 Full scan mass spectra of the three muscle relaxants

2.2 色譜條件優化

由于維庫溴銨、羅庫溴銨和泮庫溴銨均為季銨鹽類化合物,色譜柱類型和流動相組成均會對其保留時間、色譜峰形以及離子化效率產生影響,并最終影響目標物的檢測靈敏度。

實驗在保持3個目標物濃度、流速、進樣量等參數一致,且流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(80∶20, v/v)的條件下,分別考察了美國Agilent公司的SB-C8(50 mm×4.6 mm, 1.8 μm)、SB-C18(50 mm×4.6 mm, 1.8 μm)、ZORBAX HILIC Plus(50 mm×2.1 mm, 3.5 μm)和德國Merck KGaA公司的ZIC-HILIC(50 mm×2.1 mm, 3.0 μm,)、ZIC-cHILIC(50 mm×2.1 mm, 3.0 μm)等5種色譜柱對目標物色譜峰形、離子化效率和保留時間的影響(見圖2)。結果表明,采用SB-C8和SB-C18色譜柱時,20 min內沒有出現目標物色譜峰,這是由于3種帶正電荷的肌松劑極易被硅膠基色譜柱上殘留的硅羥基吸附,需在流動相中加入較高濃度的緩沖鹽或離子對試劑才能減少吸附作用,而高濃度的緩沖鹽和離子對試劑對質譜信號有抑制作用,且會對質譜系統產生不利影響[25];采用ZORBAX HILIC Plus色譜柱時,雖然色譜峰對稱性較好,但目標物的色譜峰豐度均較低,不利于提高檢測靈敏度;采用ZIC-HILIC和ZIC-cHILIC色譜柱時,色譜峰均有較好的對稱性,但在ZIC-cHILIC柱上的色譜峰豐度更高,保留效果也更好。因此選用ZIC-cHILIC為實驗色譜柱。

圖 2 不同色譜柱上3種肌松劑的提取離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion current chromatograms of the three muscle relaxants on different chromatographic columns

實驗同時考察了5 mmol/L乙酸銨水溶液,0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%甲酸水溶液等常用水相對目標物的離子化效率的影響(見圖3)。實驗中保持3個目標物濃度、流速、進樣量等參數一致,流動相中的有機相乙腈的體積分數為80%,色譜柱為ZIC-cHILIC柱。結果表明,以0.1%甲酸水溶液為水相時,3個目標物的離子化效率和保留效果均優于其他2種溶液，故選擇0.1%甲酸水溶液為流動相中的水相。

圖 3 采用不同流動相時3種肌松劑的提取離子流色譜圖Fig. 3 Extracted ion current chromatograms of the three muscle relaxants using different mobile phases

實驗以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相,采用優化后的梯度洗脫程序,對3種季銨鹽類肌松劑混合標準溶液進行分析，由其總離子流色譜圖(見圖4a)可以看出,3種季銨鹽類肌松劑在3 min內可較好的分離。

圖 4 (a)3種肌松劑混合標準溶液和(b)空白血液樣品的總離子流色譜圖Fig. 4 Total ion current chromatograms of (a) the three muscle relaxants mixed standard solution and (b) blank blood sample

2.3 樣品處理條件的選擇

考察了不同類型的固相萃取柱對目標物的凈化效果,包括OASIS MCX 3cc離子交換固相萃取柱(60 mg,美國Waters公司)、Carboxylic Acid固相萃取柱(50 mg,美國J. T. Baker公司)和Bond Elut AL-N固相萃取柱(60 mg,美國Varian公司)。參照文獻[22]方法，血液樣品先經稀釋、離心,然后取上清液過OASIS MCX 3cc離子交換固相萃取柱,以甲酸-乙腈-水(2∶48∶50, v/v/v)為洗脫劑對血液樣品進行凈化,每次用1 mL洗脫劑進行洗脫并進行檢測,結果顯示,5 mL內很難將目標物完全洗脫,其回收率低于60%;參照上述方法,采用同樣的洗脫劑,使用Carboxylic Acid固相萃取柱對血液樣品進行凈化,結果顯示,目標物與填料結合作用較強,5 mL內幾乎沒有目標物被洗脫;采用同樣洗脫劑,使用Bond Elut AL-N固相萃取柱凈化時,前2 mL洗脫液中3種目標物含量均大于97%,第4 mL洗脫液中無法檢測到目標物。因此,實驗采用Bond Elut AL-N固相萃取柱,以3 mL的甲酸-乙腈-水(2∶48∶50, v/v/v)為洗脫劑,對血液樣品進行凈化處理。

2.4 方法學考察

2.4.1專屬性和基質效應

將0.5 mL空白血液樣品采用1.3節方法進行前處理,然后進樣測定，其總離子流色譜圖見圖4b。結果表明,空白血液樣品中內源性物質對3種目標物的測定不產生干擾,方法專屬性良好。

在空白血液的前處理液中加入3種目標物,分別配制50 μg/L和100 μg/L混合基質標準溶液,進樣分析,得到目標物的峰面積(A),同時測定相同水平的混合標準溶液,得到目標物的峰面積(B)。根據公式ME=A/B×100%計算基質效應。結果表明,空白血液中維庫溴銨、羅庫溴銨和泮庫溴銨的ME值分別為89.5%～94.2%、88.1%～92.8%和90.6%～95.4%,基質效應較弱,可以使用溶劑標準曲線進行定量。

2.4.2標準曲線、檢出限和定量限

采用1.4節的儀器條件對1.2節配制的標準工作溶液進行測定。以各分析物的峰面積(Y)和對應的質量濃度(X, ng/mL)進行線性回歸,得到3種目標物的標準曲線和相關系數(R2),以特征離子色譜峰S/N≥ 3和10時目標物的含量為方法的檢出限和定量限(見表2)。結果表明,目標物在對應的濃度范圍內線性關系良好,相關系數均大于0.996,檢出限為0.2～0.8 ng/mL,定量限為0.5～1.7 ng/mL。

2.4.3加標回收率和精密度

在空白血液中分別添加4個水平(定量限、3倍定量限、200 ng/mL和500 ng/mL)的目標物,加標樣品按照1.3節方法處理后進行測定,得到3種目標物的平均回收率為92.8%～110.6%,相對標準偏差為3.2%～9.4%(n=6)(見表2)。該方法能夠較好地滿足血液樣品中3種肌松劑含量的測定要求。

表 2 3種肌松劑的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限、定量限、回收率及相對標準偏差

2.5 實際樣品的測定

采用本方法對4個實際兔子血液樣品進行測試,每個樣品均采用1.3節的方法進行前處理,結果表明,樣品中維庫溴銨、羅庫溴銨和泮庫溴銨的含量分別為231～364、173～450和287～428 ng/mL(見表3),均在本方法的線性范圍內。

表 3 4個兔子血液樣品的測定結果(n=3)

3 結論

本文通過對色譜柱、流動相、質譜測定條件以及血液樣品前處理條件的優化,建立了HPLC-MS/MS同時測定血液中維庫溴銨、羅庫溴銨和泮庫溴銨的分析方法,并應用于實際樣品的檢測。該方法前處理簡便,測定時間短,線性范圍寬,檢出限低,靈敏度高,為血液樣品中3種季銨鹽類肌松劑的同時測定提供了簡單、實用的方法。