珍珠龍膽石斑魚無水保活過程中滋味變化規律研究

步 營，王 飛，朱文慧,*，勵建榮，李學鵬,*，王明麗，郭曉華，勞敏軍

(1.渤海大學 食品科學與工程學院/生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心， 遼寧 錦州 121013；2.蓬萊京魯漁業有限公司， 山東 煙臺 265600； 3.山東美佳集團有限公司， 山東 日照 276800；4.浙江興業集團有限公司， 浙江 舟山 316120)

風味是食物刺激味覺和嗅覺受體而產生的綜合生理反應，是評價食品品質的重要指標。水產品中風味物質的種類有很多，已經被鑒定出的呈味物質包括游離氨基酸、低聚糖、有機酸、核苷酸及其關聯化合物等滋味成分和揮發性風味成分，這些物質相互作用，表現出對比、變調、相乘、消殺作用和氣味的累加、協同、融合、掩蓋等，共同產生了獨特的水產品風味[5]。由于在保活前暫養停食，饑餓、低溫使魚體產生了一些應激反應，魚體消耗了部分儲備的能量物質，基本營養成分發生了變化，同時魚肉風味也出現了一定的變化。目前，已經開展了石斑魚[5-6]、大黃魚[7]、大菱鲆[8]、花鱸[9]、鯽魚[9-12]、海鱸魚[13]等水產品在無水保活過程中的生理生化變化及脅迫機制的研究，但針對魚類無水保活過程中的風味特征變化規律報道還較少，有待進一步的深入研究。

珍珠龍膽石斑魚常采用無水保活方式進行運輸，本研究擬以珍珠龍膽石斑魚為研究對象，探討其在低溫無水保活過程中呈味成分的變化規律，希望為珍珠龍膽石斑魚保活運輸中滋味品質保持與提升提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珍珠龍膽石斑魚，購自錦州市林西路水產市場。挑選健康無疾病，體表完好的石斑魚作為實驗樣品，質量為(800±50)g，充氧(純氧)運輸至實驗室后，將其放入配置的人工海水中，水溫為(22±0.5)℃，溶氧為6 mg/mL，鹽度為2.7%±0.2%，暫養24 h以消除應激反應。

磷酸二氫鉀，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；乳酸、琥珀酸、檸檬酸、腺嘌呤核糖核苷酸(adenosine monophosphate，AMP)、次黃嘌呤核苷酸(inosinemonphosphate，IMP)、鳥嘌呤核苷酸(guanosine monophosphate，GMP)，均為色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高氯酸，分析純，福晨(天津)化學試劑有限公司；甲醇，色譜純，德國西格瑪公司。

1.2 儀器與設備

MS105DU型電子分析天平、PE28型pH計，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；L- 8900型氨基酸分析儀，日本日立公司；SA- 402B型電子舌，日本Insent公司；C18型液相色譜柱，美國安捷倫公司；Biofuge Stratos型高速冷凍離心機，美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

珍珠龍膽石斑魚停食暫養24 h后，以2 ℃/h速率勻速降溫至14 ℃，迅速將魚撈出，放入自封袋中，充入純氧后，封口，置于15 ℃生化培養箱中保存，分別于0、3、6、9、12 h取樣一次。取樣時采用木棒擊打頭部致死，采集其肌肉組織，隨后將其放入-80 ℃冰箱保存，以便后期指標測定。

1.3.1電子舌分析

參照祝倫偉[14]的方法稍做修改。準確稱取5.0 g石斑魚肉放在100 mL小燒杯中，加入95 mL蒸餾水，高速均質機均質，4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，稀釋3倍，用0.45 μm濾膜過濾備用。取70 mL過濾后的樣品液于測試杯中，使用電子舌傳感器C00、AE1、AAE、CA0和CT0在室溫下對樣品的苦味、苦味回味、澀味、澀味回味、鮮味、酸味、豐富度和咸味分別進行分析。

1.3.2核苷酸測定

參考祝倫偉[14]的方法略有修改。

標準曲線的繪制：將AMP、IMP、GMP 3種核苷酸混合標準溶液配制成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL等系列濃度標準溶液。所得標準曲線依次為：y=22 711x+410(R2=0.997)，y=36 672x-73.945(R2=0.998)，y=40 474x-118.25(R2=0.997)。

樣品前處理：取5 g石斑魚魚肉，絞碎，加入15 mL體積分數為5%的高氯酸溶液，勻漿后在4 ℃條件下4 500 r/min離心10 min，取上清液。沉淀中再次加入10 mL高氯酸，再次勻漿離心(條件同上)。將兩次得到的上清液合并后搖勻，用5 mol/L的KOH調節pH值至6.75，過0.22 μm濾膜。

色譜條件：C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)；流動相為pH值為4.3的0.05 mol/L的KH2PO4-甲醇溶液，進樣前超聲10～15 min脫氣；流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL，紫外檢測器波長為254 nm。采用梯度洗脫，程序為0～10 min，KH2PO4與甲醇的體積比為97.5∶2.5；10～17 min，KH2PO4與甲醇的體積比為85∶15；17～20 min，KH2PO4與甲醇的體積比為97.5∶2.5。

1.3.3有機酸測定

參考楊婉琳[15]的方法略有修改。

標準曲線的繪制：將混合標準溶液(包含乳酸、檸檬酸和琥珀酸等3種有機酸)配制成0.01、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL的標準溶液；將標準溶液在相同的液相條件下分別進樣，以峰面積與對應的質量濃度(mg/mL)繪制3種有機酸標準曲線，并采用外標法進行定量。3個有機酸的標準曲線依次為：y=572.47x-4.496 2(R2=0.999)，y=714.2x+7.466 9(R2=0.993)，y=1 513.6x-30.767(R2=0.997)。

樣品前處理：取5 g石斑魚魚肉，絞碎后加入15 mL體積分數為5%的高氯酸溶液，高速均質機勻漿后靜置20 min，4 ℃、7170 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾，待高效液相色譜進樣分析。

色譜條件：C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)，柱溫為25 ℃；檢測器為紫外吸收檢測器，檢測波長為205 nm；流動相為甲醇與KH2PO4(0.01 mol/L, pH值為2.8，二者體積比為5∶95)，流速為0.5 mL/min，進樣量10 μL，等梯度洗脫。

1.3.4游離氨基酸測定

參考鄧婕春等[16]的測定方法并修改。準確稱取魚肉樣品3 g，加入質量分數為15%的三氯乙酸50 mL，均質后靜置2.5 h，12 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min。取5 mL上清液，用3 mol/L NaOH將溶液pH值調節至2.0～2.5，加入蒸餾水定容至10 mL，搖勻后靜置10 min，過0.45 μm濾膜得到待測液。

氨基酸自動分析儀的條件設置：分離柱溫度為57 ℃，檢測波長為570 nm，緩沖溶液流速為0.4 mL/min；反應液為茚三酮試劑，反應液流量為0.35 mL/min；反應單元溫度為135 ℃，進樣量為20 μL。

1.4 數據分析

采用Excel 2010軟件對數據進行整理，采用Origin Pro 9.0軟件繪制曲線圖，SPSS 24.0軟件對數據進行差異性分析。顯著性分析采用Duncan多重比較法，P<0.05表示差異顯著，數值采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 石斑魚無水保活過程中電子舌分析結果

電子舌或味覺傳感器是用來確定感官屬性最常用的工具之一[17]。表1是樣品按體積比稀釋30倍后電子舌的測定結果。由表1可知，樣品中的酸味、澀味、咸味均為負數，表明其無法被人類味覺所感知，而苦味和濃厚味的響應值明顯高于其他滋味。鮮樣具有較高的苦味和苦味余味響應值，并且鮮味和澀味余味的響應值較低。無水保活后，與對照組相比，在0～3 h時，鮮味值顯著增加至最大值4.13。這可能是因為石斑魚在短時間降溫后，魚體為適應低溫環境，通過積聚氨基酸抵抗冷脅迫，親水性氨基酸，如天冬氨酸、蘇氨酸和絲氨酸能使機體中的結合水含量增加，有助于應對低溫[18]；而天冬氨酸為鮮味氨基酸，蘇氨酸、絲氨酸屬于甜味氨基酸，能夠降低苦味，增加鮮味。保活3～12 h后，鮮味值逐漸緩慢降低，12 h后降為3.52，但仍高于鮮樣。這可能是因為隨保活時間延長，石斑魚再次產生脅迫反應，體內代謝再次發生變化，產生一定量的多肽，以及不同呈味氨基酸含量發生變化，因而表現為鮮味增加、苦味降低。在12 h后，濃厚味值增加至最大值，為5.00。

表1 不同保活時間后珍珠龍膽石斑魚魚肉電子舌分析結果Tab.1 Analysis results of electronic tongue of pearl gentian grouper with different keeping alive time

圖1為電子舌PCA分析結果，由圖1可知，PC1和PC2的貢獻率分別為68.22%和22.07%，累積貢獻率為90.29%，因此，PC1和PC2包含了大量信息，可以反映樣本的總體特性。圖1中所有樣品的數據采集點分散，0 h與其余各組距離較遠，鮮樣與3、6 h距離較為接近，9 h與12 h較為接近，結合表1數據可以表明，保活3 h之后，石斑魚魚肉的滋味得到較大改善，12 h后其濃厚味最佳。

圖1 不同保活時間后珍珠龍膽石斑魚魚肉的電子舌PCA分析結果Fig.1 Electronic tongue PCA analysis results of pearl gentian grouper with different keeping alive time

2.2 石斑魚無水保活過程中核苷酸含量變化

鮮味被定義為谷氨酸引起的特征味覺，研究表明，AMP、IMP、GMP等核苷酸也能提供一定的鮮味。此外，還發現核苷酸和鮮味氨基酸之間存在協同作用，當它們以一定的比例混合時能產生更強烈的鮮味[19-20]。IMP、GMP和AMP是魚肉中的3種主要呈味核苷酸，其中IMP和AMP可以通過ATP的分解產生。在生物體內，IMP有兩種轉化方式：一部分會參與能量循環，轉變成運輸能量的物質ATP，為細胞活動提供能量；另一部分在酶的作用下進一步分解為GMP和AMP，為DNA的合成提供物質基礎。無水保活后，魚肉中的核苷酸變化如表2。表2顯示：隨著無水保活的時間增加，IMP含量隨保活時間呈現先上升后下降的趨勢(P<0.05)，在保活3 h后含量達到最大值(465.0 mg/100g)；AMP含量無顯著變化；GMP是IMP轉化的產物，GMP在保活期間也呈現先上升后下降的趨勢，保活前期，石斑魚為抵抗低溫，消耗的ATP較多，而IMP降解速度較慢，造成IMP的積累；保活后期，IMP含量的降低一方面可能是由于石斑魚在保活后期新陳代謝速率降低，能量消耗較少，分解的ATP較少[21]，另一方面，可能是無水保活導致魚體內的堿性磷酸酶活性上升，導致IMP降解增加[22-23]。滋味活性值(taste active value, TAV)是滋味物質濃度與該物質的閾值的比值。TAV反映了單一化合物對滋味的貢獻，TAV小于1表示該物質對滋味貢獻不大，TAV大于1表示該物質對滋味貢獻較大，且數值越大，貢獻越大。各處理組IMP的TAV均大于1，說明IMP對珍珠龍膽石斑魚的滋味有重要貢獻。經保活12 h后，與鮮樣相比，IMP的含量降低了60%，其TAV降低至7.20。保活12 h后，核苷酸總量顯著下降，比保活前降低了58.59%。本研究表明，無水保活不利于石斑魚核苷酸類呈味物質的積累。

表2 不同保活時間后珍珠龍膽石斑魚魚肉的核苷酸含量變化Tab.2 Changes in nucleotide content of pearl gentian grouper with different keeping alive time mg/100 g

2.3 石斑魚無水保活過程中有機酸含量變化

有機酸具有一定的呈味作用，檸檬酸略帶果香的酸味，琥珀酸呈現出酸鮮味，乳酸具有爽口的酸味。檸檬酸是有機酸中的第一大酸，琥珀酸與檸檬酸、谷氨酸鈉或氯化鈉等具有協同增鮮的作用，能顯著增強鮮味。表3為不同保活時間后珍珠龍膽石斑魚魚肉的有機酸含量變化情況。由表3可以看出，魚肉中乳酸含量顯著增加，這可能是在無水保活過程中，魚體的有氧呼吸受到抑制，無氧呼吸增強，從而導致乳酸在肌肉中積累，這與丁亞濤等[24]對鳊魚無水保活的研究結論一致。魚肉中檸檬酸含量在保活后均呈先增加后降低的趨勢，琥珀酸含量呈現出先降低后增高的趨勢。琥珀酸及檸檬酸均為三羧酸循環的中間物質，正常情況下，其變化不大，而當有氧呼吸被抑制時，兩種有機酸含量會受到一定的影響。在保活前期，魚體因冷脅迫，通過加強代謝御暖抗寒，此時有氧呼吸相對旺盛；保活后期，可能由于包裝袋內二氧化碳的積累，抑制了魚體有氧呼吸，從而導致魚體通過無氧呼吸為機體提供能量[25]。各處理組魚肉中乳酸含量差異顯著(P<0.05)，保活12 h后乳酸達到最大值，為158.70 mg/g，是鮮樣的1.40倍。保活1.2 h后，琥珀酸和檸檬酸含量分別增加了11.2%和12.7%，與周翠平[26]研究結果一致。各處理組琥珀酸、乳酸和檸檬酸的TAV值均大于1，說明3種有機酸對石斑魚的滋味有重要貢獻。無水保活后，魚肉中有機酸總量增加，表明其鮮味比保活前有所增加，對魚肉的滋味有一定的改善。

表3 不同保活時間后珍珠龍膽石斑魚魚肉的有機酸含量變化Tab.3 Changes in organic acid content of pearl gentian grouper with different keeping alive time

2.4 石斑魚無水保活過程中游離氨基酸含量變化

魚肉中的氨基酸種類及含量與捕魚的季節以及飼料中的成分有關[28]，通常情況下認為魚肉經過處理或者貯藏后，其游離氨基酸的含量及組成會發生較大變化。表4是石斑魚徑無水保活后在不同時間的游離氨基酸含量的變化情況。由表4可知，丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸經冰溫處理后有顯著升高(P<0.05)。鮮味氨基酸中谷氨酸、天冬氨酸變化較大，呈先上升后下降的趨勢，保活3 h達到最大值，含量分別為41.50、7.29 mg/100 g，顯著高于鮮樣的8.54、0.60 mg/100 g。甜味氨基酸中丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的平均值較鮮活魚大幅提高。與鮮樣組相比，休眠處理組魚肉中的游離氨基酸總量(total free amino acid, TFAA)和必需氨基酸(essential amino acid, EAA)分別是保活前的3.70倍和3.04倍，說明無水保活后石斑魚肉蛋白質營養價值得到提升。石斑魚中具有甜味的氨基酸含量相對較高，是主要呈味成分。無水保活后，甜味氨基酸(SAA)與苦味氨基酸(BAA)含量呈先上升后下降的趨勢，保活后其含量分別是保活前的6.19倍和2.38倍；鮮味氨基酸(DAA)含量是保活前的1.81倍，其中丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和賴氨酸無水保活后顯著增加，除賴氨酸呈苦味，其他3種氨基酸均呈甜味，這表明無水保活有利于魚體內游離氨基酸含量的提升，且使得魚肉的鮮甜滋味得到改善。牙鲆在低溫無水保活60 h后，天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和精氨酸下降程度超過10%，而胱氨酸則增加了27.3%[29]；鱘魚低溫保活過程中，游離氨基酸態氮含量先上升后下降，在12 h達到最大值，與本研究中魚肉的游離氨基酸變化趨勢一致。在低溫脅迫下，蛋白質會被水解為各種氨基酸，為抗應激相關蛋白質的合成與周轉提供原料，同時起到抗應激的功能[30]。在低溫無水條件下，游離氨基酸增加可能是因為魚體通過分解蛋白質獲得能量及調節體內代謝抵抗寒冷，從而增強自身的抗寒能力。

3 結 論

本研究發現，無水保活過程對石斑魚的滋味有較大影響，乳酸、琥珀酸、乳酸和檸檬酸等滋味成分對珍珠龍膽石斑魚的滋味有重要貢獻。經無水保活后，魚肉中有機酸總量和呈鮮味、甜味的游離氨基酸含量均顯著增加；而呈味核苷酸含量呈現先增加后下降的趨勢。經無水保活后，魚肉總體呈現出鮮味先增加后降低的趨勢，但仍高于鮮樣，苦味呈先增加后降低的趨勢，但仍低于鮮樣；濃厚味呈增加的趨勢，這是魚肉中的核苷酸、有機酸及游離氨基酸共同呈味作用的結果。無水保活后，有機酸和游離氨基酸含量的增加，不僅有利于魚肉滋味的改善，同時也提高了魚肉的營養價值，這表明無水保活提高了魚肉的品質，有利于魚肉的進一步加工。

表4 不同保活時間后珍珠龍膽石斑魚魚肉游離氨基酸含量變化Tab.4 Changes in free amino acid content of pearl gentian grouper with different keeping alive time mg/100 g