甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉在煙葉中的降解動態研究

張慎 肖新生 劉園 袁方 李佳穎

(1湖南省煙草公司永州市公司東安縣分公司湖南永州425100;2湖南科技學院化學與生物工程學院湖南永州425199;3湖南省煙草公司永州市公司湖南永州425100)

煙草在田間生長過程中會受到各種病蟲害的危害，病蟲害得不到有效的防治，可能會嚴重影響煙草的品質和產量，甚至導致絕收。盡管有很多生物防治等新技術涌現，但是化學農藥仍然是目前煙草病蟲害防治的主要手段［1］。甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉都屬于殺菌劑，被廣泛用于水果、蔬菜、花卉等農作物的病蟲害防治［2-4］，這3種農藥在煙草中常出現超標現象；雖然這些農藥藥效高、毒性相對較低，但是其對哺乳動物等還是有一定的毒害作用［5-10］。楊麗芬等［11］用高效液相色譜法測定蘋果中多菌靈和噻菌靈，比較SPE、QuEChERS兩種前處理方法的準確度和精密度。盧娜等［12］建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定八角中甲霜靈和抗蚜威殘留量的方法。郭宏斌等［13］采用高效液相法同時測定草莓、西瓜、生菜、西紅柿、荔枝和龍眼中烯酰嗎啉和赤霉素的殘留量。目前，關于甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉的殘留檢測和殘留降解規律問題，國內外的文獻報道較少。因此，理清這3種農藥在煙草中的降解規律，對于指導煙農規范用藥、合理用藥及保證烘烤制品安全性具有重要的意義［14］。

本研究選取甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉這3種煙草中常用的農藥為研究對象，在永州市煙葉生產技術中心試驗田開展了為期兩年的田間試驗，分別噴施1、2和4倍推薦量農藥于鮮煙葉和烤后煙葉中，考察其降解情況。為探索有效控制煙葉中農藥殘留的措施，采用液相色譜質譜聯用法檢測技術研究甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉在煙草上的農藥殘留特征，明確了3種農藥殘留水平與降解規律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

甲霜靈標準品（純度≥98.7%）、多菌靈標準品（純度≥98.7%）、烯酰嗎啉標準品（純度≥98.7%）、丙甲草胺標準品（純度≥98.7%），皆購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲霜靈（可濕性粉劑，有效成分含量為8%，浙江禾本科技有限公司）、多菌靈（可濕性粉劑，有效成分含量為50%，上海悅聯化工有限公司）、烯酰嗎啉（水分散粒劑，有效成分含量為80%，山東源豐生物科技有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA，Agela Technologies公司）；無水MgSO4、NaCl、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（均購自上海國藥集團化學試劑有限公司，且均為分析純）；乙酸乙酯（色譜純，德國Merck公司）；正己烷（色譜純，德國Merck公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；蒸餾水。

1.1.2 儀器設備

LC-MS 8030高效液相色譜質譜聯用儀（日本島津公司）；SQP萬分之一電子天平（瑞士賽多利斯公司）；A-10 basic高速植物組織搗碎機（德國IKA公司）；GL-88B渦旋混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TG16G速離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；R-1001VN旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 農藥在煙草中殘留量與降解規律田間試驗

田間試驗于2019—2020年在湖南省煙草公司永州市公司煙葉生產技術中心進行，供試煙草品種為云煙87號，整個田間生產過程符合當地農業規范（GAP）生產要求。參照農業農村部《農藥殘留試驗準則》和《農藥登記殘留田間試驗標準操作規程》，動態試驗按照1、2和4倍推薦劑量用藥，施藥2次，于旺長期-現蕾期葉背和葉面噴霧施藥。每個小區面積30 m2，行距120 cm，株距50 cm。小區試驗重復3次，隨機排列，設置小區保護帶與對照小區。煙株現蕾后期，葉面均勻噴霧施藥。1倍推薦劑量甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉的有效成分用量分別為118.5、444.4、355.6 g a.i./hm2，用水量887.7 L/hm2。間隔一個星期后，第二次施藥。于第二次施藥后2 h和1、3、5、7、14 d采樣，將樣品去主脈、切碎、混勻，用四分法留樣不少于200 g，于-20℃環境保存，待檢測。

1.2.2 煙葉烘烤前后及不同采收間隔期最終殘留量田間試驗。

于最后一次施藥后7、14、21 d，采用半葉法研究烘烤前后農藥殘留量的降解變化：隨機采集煙葉樣品100片，用半葉法稱重編桿后，采用三段式烘烤工藝進行烘烤處理；將煙葉去主脈并粉碎，縮分后留樣100 g，于-20℃環境保存，待檢測。

1.2.3 殘留檢測

1.2.3.1 農藥殘留前處理方法

參照標準《YC/T 405.1—2011煙草及煙草制品多種農藥殘留量的測定第1部分：高效液相色譜-串聯質譜法》進行適當修改。修改之處為：改用異丙甲草胺（5μg/mL）作為內標進行定量分析。

1.2.3.2 農藥殘留檢測條件

（1）LC-MS/MS色譜條件：色譜柱AQ-C18 HP（3.0μm，2.1×100 mm）；流動相為乙腈和水（V/V）；流速：0.3 mL/min；采用“15∶85（V/V，0～2.5 min）→50∶50（V/V，2.5～14 min）→95∶5（V/V，14～16 min）→15∶85（V/V，16～18 min）”進行梯度洗脫；柱溫25℃；進樣量5μL。

（2）質譜條件離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子源；噴霧電壓：3 000 V；毛細管溫度：300℃；鞘氣壓力：50 Arb；輔助氣壓力：20 Arb；檢測方式：多重反應監測（MRM，具體條件見表1），典型的色譜圖見圖1。

表1 三種農藥的MRM條件

圖1 甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉和異丙甲草胺典型TIC色譜圖

1.2.3.3 標準曲線與添加回收率

分別配置濃度為100 mg/L的甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉標準溶液；再用煙葉空白提取液稀釋，配得農藥濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/L的含內標異丙甲草胺（0.05 mg/L）的基質加標系列標準溶液，繪制標準曲線；分別往空白煙葉提取液中添加不同濃度（0.1、0.5、2 mg/kg）的甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉標準溶液，進行添加回收率檢測驗證。

2 結果與分析

2.1 標準曲線、檢出限與添加回收率

在0.005～5 mg/kg，3種農藥跟內標的峰面積比與農藥質量濃度呈良好的線性關系。以3倍信噪比進行計算，得出甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉的最低檢出限均為1.0×10-11g，同時根據最小的添加水平得到3種農藥的定量限（LOQ）為0.01～0.02 mg/kg（表2）。甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉在0.1、0.5、2 mg/kg的添加回收率分別為81.2%～98.5%、83.1%～101.5%、85.1%～101.5%，相對標準偏差分別為2.2%～5.4%、2.9%～7.5%、3.5%～7.8%。添加回收率結果均符合殘留檢測方法要求，可用于煙葉中3種農藥的殘留檢測。

表2 甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉在煙葉中的線性方程、相關系數與定量限

2.2 煙草鮮煙葉中甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉消解規律

甲霜靈在鮮煙葉中的殘留量實驗結果（圖2）表明，施藥的第一天農藥含量普遍都很高，且農藥濃度越高殘留越大。第二次施藥2 h后，1、2和4倍推薦施藥量的煙葉中甲霜靈沉積量分別為7.1、18.7、36.6 mg/kg。甲霜靈在鮮煙葉中的農藥殘留量隨著施藥間隔期的延長整體呈下降趨勢（圖2-a），且降解速率先快后慢，14 d后殘留量分別降為0.1、2.4、5.3 mg/kg，14 d時，消解率均超過85%。7 d之后，1、2倍農藥殘留量變化均漸趨平緩。至14 d時，雖還未降解完全，但殘留量已經較低。

圖2 鮮煙葉中甲霜靈（a）、多菌靈（b）、烯酰嗎啉（c）的殘留量隨施藥時間變化的曲線

多菌靈在鮮煙葉中的殘留量實驗結果表明，第二次施藥2 h后，1、2和4倍推薦施藥量的煙葉中多菌靈沉積量分別為13.3、23.8、34.9 mg/kg（圖2-b）。14 d后多菌靈殘留量分別降為2.3、4.0、8.2 mg/kg，消解率均超過75%，消解速度比甲霜靈要慢。

烯酰嗎啉在鮮煙葉中的殘留量實驗結果表明，施藥第一天農藥烯酰嗎啉殘留量最大（圖2-c）。第二次施藥2 h后，1、2和4倍推薦施藥量的煙葉中烯酰嗎啉沉積量分別為21.0、38.6、47.1 mg/kg。烯酰嗎啉在鮮煙葉中的農藥殘留量隨著施藥間隔期的延長整體呈下降趨勢，7 d后1、2和4倍農藥殘留量已趨近于平緩，14 d后殘留量分別降為1.7、2.8、5.1 mg/kg。施藥3 d后消解率均超過50%；14 d時，消解率均超過89%。

采用Excel進行線性回歸分析，按照指數方程進行擬合，得到了鮮煙葉中農藥殘留消解動態方程及半衰期，詳見表3。甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉在鮮煙葉中的殘留消解動態方程均符合一級動力學方程，甲霜靈和多菌靈趨勢線擬合程度的指標R2值在0.867 1～0.984 3，而烯酰嗎啉趨勢線擬合程度的指標R2值在0.743 6～0.781 9。不同施藥量的半衰期，甲霜靈為2～4 d，多菌靈為5～6 d，烯酰嗎啉為3～4 d。比較而言，多菌靈的降解速率要慢一些，甲霜靈和烯酰嗎啉的降解速度差不多。

表3 鮮煙葉中農藥殘留消解動態方程及半衰期

2.3 煙葉烘烤過程中甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉加工因子

為了解煙葉烤制過程中農藥的消解情況，對第二次施藥后7、14、21 d采收的煙葉烤制前后農藥殘留量進行了對比分析，發現甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉的加工因子分別在0.42～0.65、0.41～0.64和0.50～0.64，詳見表4。煙葉烘烤中的高溫過程，會促使部分農藥分解，同時烘烤過程中的高溫條件使微生物徹底失活，降低了煙葉中水分的含量，導致后期的農藥降解緩慢。

表4 煙葉烘烤過程中甲霜靈、多菌靈與烯酰嗎啉加工因子

2.4 烤后煙葉中甲霜靈、多菌靈與烯酰嗎啉消解規律

烤后煙葉在存放過程中，農藥會逐漸分解而使殘留量下降，殘留量下降速度與煙草農藥殘留安全性有較大關系。為更好地判斷不同存放期煙葉中農藥殘留情況，分別采摘第二次噴藥后第7、14、21天的煙葉，經烤制、切絲混勻后，避光放置在25℃、60%的恒溫恒濕箱中。在烤后的第0、30、60天分別取樣測定煙葉中甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉的降解情況，結果如圖3-a、3-b和3-c所示，殘留限量值均為2 mg/kg。從圖3-a中可以看出，只有第7天收獲的4倍農藥用量烤后0 d煙葉中甲霜靈含量超過煙草行業標準［15］中規定的殘留限量；烤后14 d，殘留量下降，其含量低于殘留限量值。從圖3-b可看出，不管是多少天的采收間隔期，4倍多菌靈用藥量的煙葉中殘留量均超過限量值，而對于1倍和2倍的用藥量，只有第7天收獲的2倍用藥量的煙葉中多菌靈殘留量高于限量值，其他均未超限。從圖3-c可看出，第7天收獲的4倍用藥量烤后煙葉中烯酰嗎啉的含量均超過殘留限量，而且第14天收獲的4倍用藥量烤后30 d煙葉中烯酰嗎啉的含量也大于2 mg/kg。

對含量變化曲線進行擬合，得到各個樣品的半衰期，如表5所示。無論是甲霜靈、多菌靈還是烯酰嗎啉，低濃度施藥量的樣品半衰期相對較短，最短的為102 d，最長的為211 d。

表5 烤后煙葉農藥殘留消解半衰期

圖3 烤后干煙葉中甲霜靈（a）、多菌靈（b）、烯酰嗎啉（c）殘留量隨烤后時間的變化情況

3 討論與結論

本研究是對云煙87號中甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉3種農藥的殘留量變化情況進行考查，發現其鮮葉中農藥消解均與一級動力學方程相符。在收獲前期，農藥降解速度較快，后期逐漸變緩慢；到收獲后期，殘留量降至較低水平并趨于穩定。在鮮煙葉中，噴灑農藥7 d后，農藥殘留量基本上已趨于平緩的狀態，在14 d后消解率超過85%。農藥殘留量與使用劑量呈正相關，同收獲間隔期呈負相關。收獲間隔期對煙葉中農藥殘留量的影響顯著高于施藥劑量的影響。

根據烤后煙葉的農藥殘留情況、加工因子和鮮葉中農殘降解動態方程，結合煙農施藥習慣，對各個安全系數進行分析，推導出施藥到采摘的安全間隔期。從烤后煙葉農藥殘留和施藥習慣看，3種農藥的施藥量不得超過推薦施藥量的2倍，因此接下來將基于2倍量施藥量進行探討。施藥量為2倍時，甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉的加工因子分別為0.59、0.64和0.69（7、14、21 d采樣加工因子的最高值），根據回收率測定誤差分別為18.8%、16.9%、14.9%。按最終殘留量不超過2 mg/kg，折合誤差和加工因子，計算得采摘時鮮煙葉甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉殘留量最小分別為2.63、2.67、2.52 mg/kg。按2倍量施藥動態消解方程計算，甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉的收獲間隔期t值分別為8.7、15.6、11.5 d。合理使用建議：8%甲霜靈可濕性粉劑按照推薦劑量118～236 g a.i./hm2，50%多菌靈可濕性粉劑按照推薦劑量444～888 g a.i./hm2，80%甲霜靈可濕性粉劑按照推薦劑量355～710 g a.i./hm2，均施藥2次，施藥間隔7 d；甲霜靈最后一次施藥距收獲間隔期為9 d，多菌靈最后一次施藥距收獲間隔期為16 d，烯酰嗎啉最后一次施藥距收獲間隔期為12 d。