新疆祖卡木顆粒活性成分防治新型冠狀病毒肺炎的整合藥理學和網絡藥理學研究

吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，季志紅，艾尼瓦爾·吾買爾，紫若·塔里哈提，卡依賽爾·阿布都肉蘇力，周文婷*

1新疆醫科大學藥學院；2新疆醫科大學維吾爾醫學院；3新奇康藥業股份有限公司，烏魯木齊 830011

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease in 2019，COVID-19)一種包膜RNA病毒引起的急性肺部感染。新型冠狀病毒(原名2019-nCoV，現名SARS-CoV-2)主要侵犯呼吸系統，主要表現發熱、干咳、乏力，嚴重者可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征(SARI)，膿毒癥休克，甚至多器官衰竭等[1]。它與一組SARS樣冠狀病毒在致病機制和臨床表現等方面也有較大的相似性[2]。SARS-CoV-2可與血管緊張素轉化酶II(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)結合進入細胞造成感染。SARS-CoV-2進入宿主細胞后，釋放RNA與細胞中核糖體集合，翻譯出小核糖核酸病毒的3C蛋白酶(3CLpro)[3,4]。因此3CLpro與ACE2在SARS-CoV-2的致病過程中同樣起到關鍵作用。然而至今仍缺乏有效抑制該病毒的臨床藥物。

根據2月1日新疆維吾爾自治區衛生健康委公布的《新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(維吾爾醫)治療專家共識》推薦[5]，不少新疆地產藥榜上有名。如屬于濕熱的血液質腐濁型患者，推薦酌情使用祖卡木顆粒(Zukamu granule，ZKMG)。ZKMG由山奈、睡蓮花、薄荷、大棗、洋甘菊、破布木果、甘草、蜀葵子、大黃和罌粟殼等10味中藥組成，具有較好的抗流感病毒、抗菌作用和抗炎作用[6]。

中醫藥整合藥理學研究平臺(integrative pharmacology-based research platform of traditional chinese medicine，TCMIP)V2.0以中醫藥百科全書在線數據庫(ETCM)為數據資源，包含疾病相關分子集及其功能挖掘、證候相關分子挖掘及功能分析、中藥藥性相關分子挖掘及功能分析、中藥(含方劑)靶標預測及功能分析、組方用藥規律分析、中醫藥關聯網絡挖掘、反向查找中藥(含方劑)等七大功能模塊[7]。網絡藥理學是一門以系統生物學，計算機生物學以及多向藥理學為融合的新興學科。可以從多層面網絡穩定的角度探究藥物與疾病之間相互作用機理。本研究借助中醫藥整合藥理學、網絡藥理學和分子對接，通過綜合分析祖卡木顆粒的活性成分，并通過分子對接技術對ZKMG的活性成分與3CLpro和ACE2進行分子對接，探討ZKMG對COVID-19作用的物質基礎，為其臨床應用提供一定的參考和依據。

1 數據庫及方法

1.1 ZKMG化學成分來源

基于TCMIP V2.0(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php)的中藥數據庫，收集山奈、睡蓮花、薄荷、大棗、洋甘菊、破布木果、甘草、蜀葵子、大黃和罌粟殼等中藥所含化學成分，并結合TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCMID數據庫(http://bionet.ncpid.org/)和BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)的“herb”中輸入ZKMG的10味中藥，并獲取化學成分。

1.2 候選成分的篩選

運用TCMIP V2.0的中藥成分數據庫，以“1.1”所得到的成分英文名為限定詞進行檢索，獲取其吸收、分布、代謝、排泄和毒性(ADMET)水平，數值含義0表示“good”,1表示“moderate”，2表示“low”，3表示“very low”。并結合TCMSP數據庫的中藥動學參數口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18為篩選標準對ZKMG的10中藥的化學成分進行篩選[8]。

1.3 ZKMG候選成分配體的前處理

借助ZINC數據庫(http://zinc.docking.org/)下載“1.2”所得的候選成分3D結構的mol格式文件。在PyMol軟件(https://pymol.org/)中檢查空間結構無誤后，以pdb格式保存。將結構件載入AutoDock Tools 1.5.6程序，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認可旋轉。保存為pdbqt格式，作為對接配體。

1.4 3CLpro和ACE2受體的前處理

采用AutoTools對3CLpro(PDBID：6LU7)和ACE2(PDBID：1R42)晶體結構蛋白進行預處理，刪除多余的蛋白鏈和配體、加氫去除水分子，計算Gasteiger電荷，保存為pdbqt文件，作為用于做分子對接的受體。

1.5 分子對接

以“1.3和1.4”項下得到的配體和受體使用Autodock Vina(版本：1.2，http://vina.scripps.edu/index.html)進行對接。最后取優勢構象進行分析，并用Schrodinger(https://www.schrodinger.com)作圖。

1.6 ZKMG活性成分及其核心靶標的篩選

以“1.5”項下得到的與3CLpro和ACE2具有較高結合能的成分作為活性成分。通過TCMIP V2.0中藥成分數據庫以活性成分英文名為關鍵詞檢索其靶標。按照MACCS(molecular ACCess system)分子指紋特征提取方法和Tanimoto系數定義的相似度計量方法，針對中藥化學成分和FDA上市藥物進行相似性打分，打分分數score≥0.8則為相似性藥物，并進行核心靶標的提取。

1.7 基因富集分析

為了系統闡明ZKMG治療COVID-19的作用，“1.6”項下得到的核心靶標進行GO(gene ontology)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路富集分析。并通過Cytoscape 3.7.1軟件(版本：3.7.1，https://cytoscape.org)構建中藥-活性成分-核心靶標-關鍵通路網絡圖。

2 結果

2.1 ZKMG化學成分收集及候選成分的篩選

ZKMG的10味中藥通過TCMIP V2.0的中藥數據庫只檢索到薄荷的28個、甘草的133個、罌粟殼的14個、大黃的88個、大棗的64個化學成分。在TCMSP數據庫檢索到薄荷的164個、大棗的133個、甘草的280個、大黃的92個和罌粟殼的24個。在TCMID數據庫檢索到山奈的24個、薄荷的74個、大棗的153個、甘草的172個、大黃的101個和罌粟殼的32個成分。在BATMAN-TCM數據庫檢索到薄荷的26個、大黃的58個、甘草的172個、大棗的49個、罌粟殼的27個和山奈的13個。ZKMG的10味中藥中破布木果、蜀葵子、睡蓮花和洋甘菊等中藥在4大數據庫中未被檢索到。為了避免個別認可度較高的有效成分未篩選出來，故同時查閱中國藥典(2015版)和CNKI文獻的相關成分，得到此類成分并合并至4大數據庫篩選結果中。其中破布木果16個、蜀葵子8個、睡蓮花6個和洋甘菊18個化學成分[9-13]。以上化學成分按照TCMIP V2.0數據庫的ADMET吸收水平等于0和1，以及TCMSP數據庫的OB≥30%和DL≥0.18篩選標準，并刪除重復的成分后得到48個候選成分(見表1)。

表1 ZKMG通過ADMET篩選的候選成分Table 1 Candidate compounds from ZKMG screened by ADMET

續表1(Continued Tab.1)

2.2 分子對接分析結果

將48個候選成分在通過ZINC數據庫以mol格式保存、在PyMol軟件以pdb格式保存、在AutoDock Tools 1.5.6程序以為pdbqt格式保存。以ZKMG的48個候選成分作為配體，以3CLpro和ACE2蛋白為受體，根據蛋白復合物中配體的坐標以及蛋白活性口袋進行設置，配體設置為柔性，受體剛性(圖1)。按照結合能來判斷候選成分與靶點的匹配度，一般認為配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生的作用可能性越大[14]。為了提高篩選標準，將48個候選成分的最優結合能與目前臨床推薦化學藥物，即洛匹那韋(lopinavir)、利托那韋(ritonavir)和瑞德西韋(remdesivir)等藥物進行對比。結果表明，瑞德西韋最優結合能在3個臨床推薦化學藥物中最低，為-4.9 kJ/mol，于是收集最優結合能小于該藥物的活性成分得到16個候選成分，部分結果見表2。結果可以看出來，活性成分與2019-nCoV-Mpro結合模式中可以看出來，氫鍵和π-π相互作用對小分子與蛋白的識別和穩定性起著關鍵作用。

圖1 2019-nCoV-Mpro與原配體的三維結構圖Fig.1 Three dimensional structure of 2019-nCoV-Mpro and original ligand

表2 ZKMG候選成分與作用于COVID-19靶點的分子對接Table 2 Molecular docking between ZKMG candidate components and COVID-19 targets (binding energy≤-4.9 kJ/mol)

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

2.3 核心靶標的篩選

以上得到的16個活性成分通過TCMIP V2.0中藥靶標數據庫以score≥0.8為標準進行篩選。其中gancaonin B、licoisoflavone B、glycyrol、lupiwighteone、glyzaglabrin、medicarpin等6個活性成分沒有預測打分分數score≥0.8的核心靶標。其他10個活性成分有465個核心靶標，去重復得到91個核心靶標。

2.4 基因富集分析結果

利用R語言(cluster profile包)對篩選的91個核心靶標進行GO富集分析及KEGG信號通路富集分析。其中GO富集分析中共得到BP為133個，CC為31種，MF為62種。根據校正后P值進行排序，選擇前各10個基因進行圖形顯示，見圖2。KEGG通路富集分析篩選得到53條信號通路，根據校正后P值進行排序，選擇前15個基因進行圖形展示(見圖3)。

圖2 ZKMG治療COVID-19核心靶標的GO基因功能富集分析Fig.2 Functional enrichment analysis of GO gene in the treatment of COVID-19 with active components of ZKMG

圖3 ZKMG治療COVID-19核心靶標的KEGG信號通路富集分析Fig.3 Enrichment analysis of KEGG signaling pathway of hub target in the treatment of COVID-19 with active components of ZKMG

2.5 中藥-活性成分-核心靶標-關鍵通路多維網絡分析

為了系統的闡明ZKMG對COVID-19的作用，構建中藥-活性成分-核心靶標-關鍵通路多維網絡，見圖4。ZKMG的10味中藥中罌粟殼不包含10個活性成分。其余9味中藥中來自于甘草的5個活性成分、來自于洋甘菊和薄荷的各3個活性成分、來自于山奈，蜀葵子和睡蓮花的各2個活性成分以及自于大黃和大棗的各1個活性成分。中藥-活性成分-核心靶標-關鍵通路多維網絡包括9味中藥、10個活性成分、91個核心靶標以及15個關鍵通路。活性成分通過聯合調控細胞色素P450超家族(CYP1A2、CYP19A1、CYP3A4、CYP3A7、CYP1B1、CYP3A5、CYP2E1、CYP2C9、CYP2D6)參與藥物代謝-細胞色素P450(drug metabolism-cytochrome P450)和細胞色素P450對外源物質代謝的影響(metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)，γ-氨基丁酸受體家族(GABRA2、GABRG1、GABRA3、GABRA1、GABRG2、GABRA4、GABRA6、GABRA5、GABRG3)參與γ-氨基丁酸能突觸(GABAergic synapse)和神經活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)以及PIK3CG、AKT1和CDK6同時參加非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)和小細胞肺癌(small cell lung cancer)。

圖4 ZKMG治療COVID-19的“中藥-化學成分-核心靶標-關鍵通路”多維網絡關系Fig.4 The multidimensional network relationship of “TCM-chemical compound-hub target-key pathway” of ZKMG for treatment COVID-19

3 討論

TCMIP V2.0是有利于克服中藥現代研究中“化學成分體內過程-藥理活性-病征效應”之間“碎片化”現象，形成中藥特色的藥理學評價體系和研究方法。本文通過中醫藥整合藥理學平臺和網絡藥理學結合發現，ZKMG的16個活性成分與2019-nCoV-Mpro和ACE2最優結合能小于符合臨床推薦化學藥物。按照MACCS分子指紋特征提取方法和Tanimoto系數定義的相似度計量方法，16個活性成分與FDA上市藥物進行相似性打分，結果表明，其中木犀草素、毛綱草酚、大黃酸、芒丙花素、山奈甲黃素、半甘草異黃酮B、異鼠李素、洋芫荽黃素、山奈酚和槲皮素等10個活性成分滿足score≥0.8的要求。其中木犀草素(luteolin)通過其抗炎和抗氧化活性抑制膿毒癥誘導的膿毒癥誘導的急性肺損傷[15]。大黃酸(rhein)通過改善肺部微血管屏障，從而有效改善油酸所致急性肺損傷大鼠肺部炎癥及水腫[16]。芒柄花黃素(formononetin)誘導肺癌細胞A549凋亡，抑制其生長[17]。Kaempferide通過降低Akt和claudin-2表達，增強人肺腺癌A549細胞的化療敏感性[18]。香葉木素(diosmetin)通過降低動脈氧合指數及炎性因子表達水平,對胎糞誘導的新生大鼠急性肺損傷具有一定的治療作用[19]。感染SARS-CoV-2病毒的患者有大量的INF-γ、MCP-1、IP-10和IL-Iβ[21]。SARS-CoV-2病毒感染導致了抑制炎癥的IL-4和IL-10的分泌增加[22]。槲皮素(quercetin)會下調IL-6、IL-1β和TNF以及上調IL-10而發揮抗炎作用[22]。而山柰酚(kaempferol)通過減輕氧化應激以及顯著降低支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子，抑制NF-κB信號通路，從而對病毒誘導的急性肺損傷小鼠產生保護作用[23]。以上都是對新疆祖卡木顆粒活性成分防治COVID-19的預測結果提供佐證。其中圣草酚(eriodictyol)、半甘草異黃酮B(semilicoisoflavone B)和異鼠李素(isorhamnetin)等成分的研究報道較少，需要進一步研究。

中藥-活性成分-核心靶標-關鍵通路多維網絡分析結果表明，ZKMG中存在一個活性成分與多個核心靶標作用，同時也存在不同活性成分用于同一個核心靶標的現象，這體現了中藥多成分與多靶標之間共同作用的機制。KEGG通路分析得出，PIK3CG、AKT1和CDK6等核心靶標同時參加神經系統、內分泌和免疫應答相關的信號通路以及肺部最為相關的小細胞肺癌和非小細胞肺癌。

綜上所述，木犀草素、毛綱草酚、大黃酸、芒丙花素、山奈甲黃素、半甘草異黃酮B、異鼠李素、洋芫荽黃素、山奈酚和槲皮素等10個活性成分可能通過與3C類似蛋白酶結合作用于多靶點、多通路的協同作用來發揮療效的，從而起到輔助治療COVID-19 的作用。鑒于整合藥理學和分子對接的局限性，需要開展實驗研究，為ZKMG治療COVID-19以及后期的藥物開發提供理論和實驗依據。