一測多評法測定不同產(chǎn)地巴戟天中4種環(huán)烯醚萜含量

王麗麗，崔慶艷，張素中，王永生，王詩涵

1中山大學(xué)新華學(xué)院 藥學(xué)院，廣州 510520；2吉林大學(xué) 藥學(xué)院，長春 130021；3吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，長春 130118

巴戟天來源于茜草科(Rubiaceae)植物巴戟天(MorindaofficinalisHow.)的干燥根[1]，該中藥材始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，歷代本草都有記載，是著名的保健中藥材，也是我國“四大南藥”之一，以廣東為道地產(chǎn)區(qū)，具有抗骨質(zhì)疏松、補(bǔ)腎陽、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[2,3]。巴戟天中主要成分有環(huán)烯醚萜類、蒽醌類、糖類及有機(jī)酸類等[3,4]。以水晶蘭苷為代表的環(huán)烯醚萜類成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗肥胖等作用[4-8]。車葉草苷還具有骨保護(hù)作用和降低急性肺損傷的作用[9]。

近年來，隨著人們的意識以醫(yī)療為重點(diǎn)轉(zhuǎn)向以預(yù)防保健為重點(diǎn)，巴戟天的需求量不斷提升，逐漸出現(xiàn)了以次充好的現(xiàn)象。《中國藥典》2015年版巴戟天含量測定項(xiàng)選用耐斯糖一種成分作為定量指標(biāo)[1]，存在一定的局限性，若能將多個指標(biāo)性成分同時納入定量指標(biāo)，將對巴戟天的品質(zhì)會有更全面的評估。

一測多評法是利用中藥材有效成分之間的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系，通過測定一種成分(對照品易于獲得)而實(shí)現(xiàn)多種成分(對照品難以獲得或價格昂貴)的同步測定，該方法是《中國藥典》2015版重點(diǎn)推廣的方法，現(xiàn)已成為中藥材多指標(biāo)成分含量測定的首選方法[10]。但當(dāng)前國內(nèi)外尚無采用一測多評法測定其含量的報道。

本實(shí)驗(yàn)建立一測多評法，首次實(shí)現(xiàn)對巴戟天中4種環(huán)烯醚萜類成分水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸、車葉草苷酸、車葉草苷的同步測定，并對不同產(chǎn)地巴戟天進(jìn)行質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

1 儀器和試藥

Agilent 1260 型液相色譜儀(安捷倫公司)；Waters Alliance E2695型液相色譜儀(沃特世公司)；LC-10ATVP型島津液相色譜儀(產(chǎn)地：日本)；色譜柱：Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Sartorious型十萬分之一天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；WP-UP-Ⅲ-10型超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)。

水晶蘭苷(批號：5945-50-6，成都埃法生物科技有限公司)；去乙酰基車葉草苷酸(批號：14259-55-3，成都埃法生物科技有限公司)；車葉草苷酸(批號：25368-11-0，成都埃法生物科技有限公司)；車葉草苷(批號：14259-45-1，成都埃法生物科技有限公司)；11批巴戟天樣品來源信息見表1，經(jīng)吉林大學(xué)王廣樹教授鑒定，為茜草科(Rubiaceae)植物巴戟天(MorindaofficinalisHow.)的干燥根；乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；水為超純水(自制)；其余試劑均為分析純。

表1 11批巴戟天樣品來源信息Table 1 Eleven batches of M.officinalis source information

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液+0.01 mol/L磷酸氫二鉀緩沖鹽(B)，梯度洗脫(0～12 min，1% A；12～30 min，1%A→17% A；30～40 min，17% A)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為235 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸、車葉草苷酸和車葉草苷對照品適量，制成質(zhì)量濃度分別為2.540 0、0.840 0、5.025 0×10-2、2.028 0×10-2mg/mL的混合對照品儲備液。精密量取混合對照品儲備液適量，制成質(zhì)量濃度依次為0.635 0、0.210 0、1.256 2×10-2、5.070 0×10-3mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取巴戟天藥材粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80% 的甲醇，超聲提取30 min(功率為400 W，頻率為90 Hz)，過濾，濾渣再同法提取一次，合并提取液，水浴蒸干，用初始流動相溶解。過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液和供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，混合對照品溶液與供試品溶液在相同時間處均有相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，各色譜峰分離較好，分離度均大于1.5；空白溶劑在相應(yīng)保留時間處沒有色譜峰出現(xiàn)，對測定無干擾；理論塔板數(shù)以所測目標(biāo)成分計(jì)均大于8 000(見圖1)。

圖1 混合對照品溶液(A)和樣品(B)HPLC圖譜Fig.1 HPLC of reference substances(A)and samples(B)注：1：水晶蘭苷；2：去乙酰基車葉草苷酸；3：車葉草苷酸；4：車葉草苷。Note:1:Monotropein;2:Deacetyl asperulosidic acid;3:Asperulosidic acid;4:Asperuloside.

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品儲備液1.25、2.50、3.75、5.00、7.50 mL，置于20 mL量瓶中，加入初始流動相定容。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，以4種成分的質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 4種環(huán)烯醚萜成分的線性關(guān)系考察Table 2 Investigation on the linear relationship of four kinds of iridoids

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸、車葉草苷酸、車葉草苷峰面積的RSD分別為0.17%、0.08%、0.36%、0.47%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸、車葉草苷酸、車葉草苷峰面積的RSD值分別為0.97%、0.43%、0.94%、1.31%(n=6)，表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批巴戟天藥材粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并按ESM法計(jì)算4種成分的含量。結(jié)果，水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸、車葉草苷酸、車葉草苷的平均含量分別為12.02、3.85、0.12、0.08 mg/g，RSD分別為0.74%、0.80%、1.08%、1.34%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批巴戟天藥材粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，按樣品含量-對照品約(1∶1)的比例加入一定量對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸、車葉草苷酸、車葉草苷的回收率分別為100.03%、99.97%、99.35%、99.68%，RSD分別為0.32%、1.05%、0.93%、1.01%(n=6)，表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

2.9 相對校正因子的測定

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液5、10、15、20、30 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以去乙酰基車葉草苷酸(Ⅱ)為內(nèi)參物，根據(jù)公式按公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak)[11]，式中Ak為內(nèi)參物峰面積，Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量或濃度，Am為其他組分m的峰面積，Wm為其他組分的質(zhì)量或濃度。以去乙酰基車葉草苷酸(Ⅱ)為內(nèi)參物，分別計(jì)算水晶蘭苷(Ⅰ)、車葉草苷酸(Ⅲ)、車葉草苷(Ⅳ)的相對校正因子(見表3)。

表3 巴戟天中3種環(huán)烯醚萜類成分相對校正因子Table 3 Relative correction factors of three iridoids in M.officinalis

2.9.1 不同儀器及色譜柱對相對校正因子的影響

考察三種不同型號儀器Agilent 1260、Waters E2695、LC-10ATVP液相色譜儀和兩種不同色譜柱Venusil MP C18和Agilent ZORBAX SB-Aq(均為250 mm×4.6 mm，5 μm)對相對校正因子的影響，分別計(jì)算各成分的相對校正因子及RSD值。結(jié)果表明，使用不同儀器和色譜柱，各成分相對校正因子的RSD值均小于2.00%(見表4)。

表4 不同儀器和色譜柱對相對校正因子的影響Table 4 Effect of different instruments and columns on relative correction factors

2.9.2 不同實(shí)驗(yàn)人員對相對校正因子的影響

考察了3名實(shí)驗(yàn)人員對各成分相對校正因子的影響，各成分相對校正因子的RSD值均小于2.00%(見表5)。

表5 不同實(shí)驗(yàn)人員對相對校正因子的影響Table 5 Effect of different experimenter on relative correction factors

2.9.3 待測成分色譜峰的定位

采用相對保留時間定位法，考察其在3個高效液相色譜色譜儀、2個不同色譜柱上各待測組分色譜峰的相對保留時間(t)和重現(xiàn)性。結(jié)果表明，在相同的色譜條件下，各成分相對保留時間在不同儀器和色譜柱條件下變化較小，RSD值均小于4.00%(見表6)。

表6 不同儀器和色譜柱對相對保留時間的影響Table 6 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.10 樣品含量測定

取11批不同產(chǎn)地巴戟天樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備巴戟天樣品溶液，每個產(chǎn)地的藥材平行制備2份樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，分別用外標(biāo)法(ESM)和一測多評法(QAMS)計(jì)算各成分的含量，并將兩種方法的含量測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于2.00%，表明外標(biāo)法與一測多評法測定結(jié)果之間無明顯差異，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的同時測定巴戟天中4種成分的一測多評法準(zhǔn)確性良好(見表7)。

表7 不同產(chǎn)地巴戟天4種環(huán)烯醚萜測定結(jié)果Table 7 Determination of four iridoids in M.officinalis in different areas

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑(70%、80%、90%甲醇)、不同提取方法(超聲提取法、加熱回流提取法)以及不同提取時間(20、30、40 min)，綜合考慮各種因素，如提取方法的易操作性、運(yùn)行成本、待測成分的提取率，最終確定巴戟天供試品溶液的制備方法以80%甲醇為提取溶劑、超聲提取2次、每次提取時間為30 min。

本實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇-磷酸水和乙腈-磷酸水作為流動相，發(fā)現(xiàn)以乙腈-磷酸水作為流動相時，各待測成分峰形及分離度較好，理論塔板數(shù)也較高，最終確定了流動相：乙腈(A)～0.2% 磷酸溶液 + 0.01 mol/L磷酸氫二鉀緩沖鹽(B)，梯度洗脫(0～12 min，1% A；12～30 min，1% A→17% A；30～40 min，17% A)。

因去乙酰基車葉草苷酸對照品價格便宜、容易獲得、性質(zhì)穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)將去乙酰基車葉草苷酸為內(nèi)參物進(jìn)行一測多評分析。

本實(shí)驗(yàn)建立的QAMS法，首次實(shí)現(xiàn)對巴戟天中4種環(huán)烯醚萜類成分水晶蘭苷、去乙酰基車葉草苷酸、車葉草苷酸、車葉草苷的同時測定。通過方法學(xué)考察、相對校正因子耐用性實(shí)驗(yàn)以及QAMS法計(jì)算值與ESM法實(shí)測值RSD值的比較，表明本文所建立的方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。解決了傳統(tǒng)多指標(biāo)成分評價模式對照品使用量大，檢測成本高，部分對照品不易獲得等不足。可為全面評價巴戟天的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

不同產(chǎn)地巴戟天各成分含量存在差異，其中以水晶蘭苷的含量差異較為明顯，其中第9批和第10批的水晶蘭苷含量較低，其原因可能與巴戟天來源于不同產(chǎn)地有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的QAMS法，方法準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好，可為巴戟天的質(zhì)量控制提供新的方法。