基于網絡藥理學及分子對接探討桑葉-菊花治療高血壓的作用機制

郭錦晨，王 莖，孫宇潔，馮 燁

1安徽中醫藥大學研究生院，合肥 230012；2安徽中醫藥大學新安醫學教育部重點實驗室，合肥 230038

高血壓是一個由環境因素和遺傳因素共同導致的多基因遺傳性疾病，以體循環動脈血壓升高為主要特征，可伴有心、腦、腎等器官的功能或器質性損害，是我國常見的心腦血管疾病之一，也是導致腦卒中、冠心病、心力衰竭的主要危險因素[1]。隨著我國居民生活水平的日益提高，高血壓呈不斷增高趨勢，如治療不及時，嚴重影響人類健康與生命。中醫學將高血壓病歸屬于“頭痛”“眩暈”“風眩”等范疇，病因病機多因臟腑氣血陰陽失調，風、火、痰、瘀、虛相兼為患，正虛為本，邪實為標，臨床上多呈虛實夾雜的致病特點。治療上中藥具有多效性、增效減副性、多靶點性、前瞻性等特點，能夠保護高血壓患者靶器官、減輕毒副作用、提高生活質量[2]，發揮著獨特的優勢作用。

桑葉(Folium Mori，FM)是桑科植物桑MorusalbaL.的干燥葉，菊花(Flos Chrysanthemi，FC)為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序。兩者甘寒體輕，均入肺、肝二經，臨床常協同為用，并走上焦疏風清熱，同入下焦清熱平肝、益陰明目，在《通俗傷寒論》羚角鉤藤湯中二藥為臣，平肝潛陽，清熱息風，以助君藥清熱平肝之力。臨床兩者配伍常可用于治療風熱感冒、肺熱咳嗽、溫病初起、肝陽上亢頭痛眩暈、目赤腫痛、目暗昏花、瘡癰腫毒等，現代醫家常取桑葉-菊花藥對平肝清肝之功用于高血壓的治療，能夠較好緩解高血壓所引起的頭痛、眩暈、目赤腫痛等癥狀[3]，但桑葉-菊花降壓的藥效物質基礎和作用機制尚不明確，研究報道亦較少。為此，本研究采用網絡藥理學及分子對接方法，分析桑葉-菊花治療高血壓的藥效物質基礎，探究其降壓的潛在分子作用機制，以期為相關的基礎實驗研究及臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 GEO芯片數據的獲取與處理

GEO數據庫(gene expression omnibus，https://www.Ncbi.Nlm.nih.gov/geo/)是美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的基因表達綜合庫，以“hypertension/normal”為關鍵詞，來源為“Homo sapiens”，從該數據庫下載GSE75940基因表達譜的原始數據，所選取芯片利用R語言3.6.3進行數據標準化。從中篩選高血壓樣本4例，正常樣本4例。所有樣本均采用GPL13497[Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2(Probe Name version)]平臺檢測，根據平臺注釋信息將探針轉化為基因名。

1.2 差異基因的篩選

芯片進行處理和轉化后，利用R語言3.6.3(https://www.r-project.org/)中的limma包按照P-value<0.05，|log2FC|>0.5(FC表示差異表達基因上調或下調倍數)的篩選條件篩選高血壓和正常動脈血管平滑肌細胞的差異表達基因，負數代表下調、正數代表上調，對差異基因進行聚類分析，利用R語言3.6.3中的pheatmap包繪制火山圖。

1.3 桑葉-菊花藥物活性成分及作用靶點的篩選

通過檢索中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php)檢索桑葉、菊花的化學成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和藥物相似性(drug-like，DL)≥0.18作為篩選條件，時間截止至2020年4月7日，篩選出活性成分較高的化合物。

1.4 “化合物-靶點”的網絡構建及可視化分析

從DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/)整合得到藥物活性成分靶點，利用Venn在線軟件(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將藥物與高血壓差異表達基因相關靶點取交集，運用Cytoscape3.7.2(http:/ /www．cytoscape．org/)軟件構建桑葉-菊花與高血壓“化合物-靶點”網絡并進行可視化分析。

1.5 蛋白網絡互作構建及拓撲分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件中Bisogenet插件對桑葉-菊花與高血壓關鍵靶點進行蛋白網絡互作分析(protein-protein interaction，PPI)，再用CytoNCA插件對網絡中所有點的拓撲參數度中心性(degree centrality，DC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和介度中心性(betweenness centrality，BC)進行分析，借助網絡拓撲理念篩選網絡中的關鍵節點，篩選標準為DC大于所有節點2倍DC中位數，CC、BC大于所有節點對應值的中位數。

1.6 GO功能富集和KEGG通路分析

將關鍵靶點上傳至David 6.8(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)數據庫(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)，以人類為研究對象，進行基因功能(GO，gene ontology)分析以了解靶點主要的作用過程，主要包括生物過程(biological process，BP)，細胞組成(cellular component，CC)，分子功能(molecular function，MF)三方面。利用R語言3.6.3中的“clusterProfiler”包對關鍵靶點進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/)富集分析，并使用“ggplot2”包繪制氣泡圖，clusterProfiler優勢在于可以實時抓取KEGG最新版本注釋得到更具時效性的富集注釋結果。

1.7 分子對接驗證

檢索RSCB PDB數據庫(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)并下載高血壓靶蛋白的3D結構，檢索并下載TCMSP數據庫桑葉-菊花活性成分的2D結構，利用Chem3D進行結構優化。利用PyMOL 2.4.0軟件對高血壓靶蛋白進行除水、分離原配體等預處理。利用AutoDock的可視化軟件AutoDock Tools 1.5.6軟件設置GridBox各項參數，應用AutoDock Vina軟件進行分子對接，最后運用PyMOL、LigPlot+軟件對對接結果進行三維和二維可視化分析。

2 結果

2.1 高血壓差異基因的篩選

基于GEO基因數據庫GSE75940的基因片段原始數據，設置log2(fold change)的絕對值>0.5和P-value<0.05為篩選標準，總共得出5 989個高血壓差異表達基因，其中包括2 864個下調基因和3 125個上調基因(見圖1)；下調和上調最顯著的40個基因見表1。

圖1 高血壓差異表達基因的火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in hypertension

表1 高血壓差異表達的上調下調基因Table 1 Up-regulated and down-regulated genes differentially expressed in hypertension

續表1(Continued Tab.1)

2.2 桑葉-菊花活性成分的篩選

在TCMSP中檢索桑葉-菊花所有成分數據，根據口服生物利用度OB和藥物相似性DL，同時篩去無對應靶點的成分，最終篩選出桑葉25個主要活性成分，菊花17個主要活性成分(見表2)。

表2 桑葉-菊花的有效活性成分Table 2 Active components of FM-FC

續表2(Continued Tab.2)

2.3 “化合物-靶點”的網絡構建及可視化分析

將DrugBank數據庫得到的所有靶點，刪除重復并去除假陽性，整合得到桑葉、菊花活性成分作用靶點241個，與高血壓差異表達基因相關靶點取交集得到基因靶點41個，涉及桑葉-菊花活性成分29個，通過Cytoscape 3.7.2軟件構建桑葉-菊花與高血壓“化合物-靶點”的可視化網絡圖(見圖2)，主要活性成分有槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、花生四烯酸、金合歡素、木犀草素等，關鍵基因有JUN、MMP9、PTGS2、EGFR、CCND1、MMP1、SPP1等。

圖2 桑葉-菊花與高血壓“化合物-靶點”的可視化網絡圖Fig.2 Visualized network diagram of "compound-target" between FM-FC and hypertension注：藍色三角形節點代表作用靶點，橢圓形節點代表有效成分化合物(綠色為桑葉；黃色為菊花；紅色為桑葉-菊花)。Note:The blue triangle node represents the action target,and the oval node represents the active ingredient compound (green is FM;yellow is FC;red is FM-FC).

2.4 蛋白網絡互作構建及拓撲分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件中Bisogenet插件對41個關鍵靶點進行蛋白網絡互作分析，得到由2 303個節點和45 586個邊組成的網絡，與高血壓上調下調最顯著的差異表達基因交集的有IGFBP5、KIF5C、SH2D2A、MEP1B、F2、PZP。再用CytoNCA插件對網絡中所有點的拓撲參數(DC、CC和BC)進行分析，選擇靶點DC值大于中位數2倍作為篩選核心靶點的條件，初步得到619個節點和20 405個邊組成的網絡，二次篩選以CC值>0.518得到310個節點和9 983個邊組成的網絡，最后BC值>147進一步篩選，構建了1個具有156個節點和3 808條邊的桑葉-菊花與高血壓的靶點網絡(見圖3)。拓撲分析出156個核心靶點信息，根據DC>185列舉出前50個見表3。

圖3 蛋白網絡互作構建及拓撲分析Fig.3 Interaction construction and topological analysis of protein networks

表3 拓撲分析156個核心靶點信息(DC>185)Table 3 Topological analysis of 156 core target information (DC>185)

續表3(Continued Tab.3)

2.5 GO功能富集分析

利用DAVID平臺進行GO功能富集分析，包括生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)3個分支，設定閾值P<0.05，對篩選得到的41個關鍵靶點進行分析(見圖4)，這些靶點主要涉及對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、對平滑肌細胞增殖的正向調節(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)、缺氧反應(response to hypoxia)等52條生物過程。CC分析可以看出靶點主要涉及細胞外空間(extracellular space)、內質網膜(endoplasmic reticulum membrane)、細胞膜筏(membrane raft)等15條細胞組分。MF分析中可以看出，靶點主要涉及酶結合(enzyme binding)、絲氨酸內肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、蛋白質均聚活性(protein homodimerization activity)等13條分子功能。

圖4 桑葉-菊花活性成分治療高血壓靶點的GO富集分析Fig.4 GO Enrichment analysis of active components from FM-FC in treating hypertension

2.6 KEGG通路富集分析

使用clusterprofiler R包對41個關鍵基因進行KEGG通路分析，設定閾值為P<0.05，得到的39條KEGG通路富集，并繪制氣泡圖和通路-關鍵基因關系網絡，結合表4和圖5、圖6，可知基因主要集中在IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、催產素信號通路(Oxytocin signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)等通路上，主要基因有JUN、PTGS2、MMP9、PRKCA、CCND1、EGFR、CASP8、ELK1等。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖(前20條)Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis (top 20)

圖6 KEGG通路-關鍵基因關系網絡Fig.6 KEGG pathway-key gene relationship network

表4 KEGG通路富集分析(前20條)Table 4 Enrichment analysis of KEGG pathway (top 20)

2.7 分子對接分析

將槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、花生四烯酸、金合歡素、木犀草素等桑葉-菊花的主要活性成分與JUN、PTGS2、MMP9、MMP1、CCND1等高血壓核心靶點進行逐一對接，結合能小于0提示配體與受體可自發結合，且結合構象越穩定，所需結合能越低，≤-4.25 kcal/mol說明有一定結合活性，≤-5.0 kcal/mol說明有較好結合活性，≤-7.0 kcal/mol說明有強的結合活性(見圖7)。本研究選取結合能<-9.0 kcal/mol作為篩選條件(見表5)，同時運用PyMOL和LigPlot+軟件將結合能前5位的對接結果制作2D和3D對接示意圖。綜合分析，槲皮素、木犀草素可能是桑葉-菊花降壓的關鍵活性成分。

表5 桑葉-菊花活性成分與靶點的結合能Table 5 Binding energy of active components of FM-FC to targets

圖7 桑葉-菊花活性成分與靶蛋白對接二維及三維圖(結合能≤9.8 kcal/mol)Fig.7 Two-dimensional and three-dimensional maps of docking between active components of FM-FC and target protein (binding energy ≤9.8 kcal/mol)注：A～E分別為氧化血根堿與PTGS2、木犀草素與MMP9、桑辛素D與PTGS2、桑辛素H與PTGS2、β-胡蘿卜素與PTGS2的分子對接圖。Note:A-E are molecular docking diagrams of sanguinarine oxide and PTGS2,luteolin and MMP9,moracin D and PTGS2,moracin H and PTGS2,and β-carotene and PTGS2,respectively.

3 討論

高血壓是腦卒中及冠心病發病的首要危險因素，是全球導致死亡的最重要因素之一，中醫病因病機復雜，病機多見陰虛陽亢動風、痰濕瘀血阻滯等，病位多責之于肝、腎、脾，現代醫學認為其發病受多個環節、多種機制(RAAS、氧化應激、炎癥、神經-免疫因素、非編碼RNA)和多種因素相互影響[4]。桑葉“乃箕星之精，箕好風，故善搜風”(《成方便讀》)，菊花 “得金水之精英尤多，能益金水二臟也。補水所以制火，益金所以平木”(《本草綱目》)，桑葉、菊花是臨床常用的經典藥對，雖為輕平之品，但可益肺平肝，使腎水充足，涵養肝性，清泄肝熱，常用治療高血壓引起的眩暈、頭疼、急躁易怒、面紅目赤等癥，但具體藥學物質和作用機制仍不清楚。本研究運用網絡藥理學研究模式，篩選出桑葉-菊花與高血壓41個共同作用蛋白，涉及活性成分29個，拓撲分析出156個核心靶點信息，39條通路與高血壓有關，體現了桑葉-菊花“多成分、多靶點、多途徑”之間共同作用治療高血壓的機制。

根據表2、圖2可知，治療高血壓的主要活性成分可能有槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、花生四烯酸、金合歡素、木犀草素等，其中槲皮素、山奈酚為桑葉-菊花共有，槲皮素可減少氧化應激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)和以內皮依賴性和改善血管內皮-1(ET-1)和NO平衡，從而改善血管內皮功能，降低血壓[5]。山奈酚可內皮依賴性舒張血管，抑制血管緊張素Ⅱ導致的血管重構，還可通過抑制IKK/NF-κB炎癥損傷IRS-1改善II型糖尿病大鼠的胰島素抵抗，并對其具有調血脂作用[6]。β-胡蘿卜素能降低低密度脂蛋白(LDL)氧化，消除自由基，預防血管損傷[7]。花生四烯酸是桑葉所含脂類，有防治動脈粥樣硬化和抗血栓的作用[8]。金合歡素、木犀草素是菊花中含有的黃酮類化合物，菊花總黃酮可調節NO介導途徑控制鈣、鉀離子通道，具有保護血管舒張反應性、擴張血管等作用[9]，木犀草素還具有清除自由基和保護細胞能力，且在體內與其他抗氧化劑協同顯著增加抗氧化作用。此外，收集到主要活性成分治療高血壓靶點41個，涉及多個炎癥、抗氧化、血管生成、血管重構等因子，表明了桑葉-菊花可通過多成分、多靶點發揮協同降壓作用。

網絡拓撲分析是從蛋白相互作用網絡體系中多層次、多角度地挖掘相關信息，并從中篩選出具有特定信號節點的多靶點藥物分子，為預測藥物與疾病之間的相互關系提供參考[10]。本研究對41個關鍵靶點進行蛋白網絡互作及拓撲參數分析，得到1個以EGFR、JUN、PRKCA為核心靶點的具有156個節點和3 808條邊的靶點網絡，一方面進一步篩選了關鍵靶點，一方面擴大了相關基因網絡，為GO功能富集、KEGG通路分析和分子對接驗證提供了佐證。根據拓撲分析結果表3、圖3，結合表1和圖2、6可知，其中關鍵作用靶點有JUN、MMP9、PTGS2、EGFR、CCND1、MMP1、SPP1、PRKCA、ELK1、IGFBP5、KIF5C、SH2D2A、MEP1B、F2、PZP等。研究表明，高血壓發病機制主要與RAAS激活、交感神經活動亢進、胰島素抵抗、水鈉潴留、膜離子轉運異常及血管內皮功能紊亂等有關[11]，導致血管收縮、損傷、重構，血壓升高。其中，Jun激酶(JUN)通過轉錄調控調節VSMCs增殖、遷移、ROS產生和胞外基質降解的細胞過程的多種基因[12]。基質金屬蛋白酶9(MMP9)參與正常生理過程中細胞外基質的分解，可通過釋放血管內皮生長因子(VEGF)以參與血管生成，而基質金屬蛋白酶1(MMP1)活性增高，高血壓相關的微血管功能障礙的風險亦增高[13]。前列素內環氧化物合成酶2(PTGS2)是一種誘導性即刻反應基因，受到細胞因子、炎性介質、缺氧等刺激可迅速上調，主要產物前列腺素具有促進細胞增殖、促進血管生成等生物學活性[14]。表皮生長因子受體(EGFR)廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、角質細胞等細胞表面，對細胞的生長、增殖和分化等有重要作用，功能缺失或其相關信號通路關鍵因子活性異常，均會引起心血管疾病及免疫缺陷等發生[15]。周期蛋白D1基因(CCND1)具有調節細胞周期、細胞生長、細胞分化的作用，在細胞受到損傷時啟動子上游的LncRNA的轉錄產物可與TNA結合蛋白TLS結合[16]。蛋白激酶C-α(PRKCA)基因是絲氨酸-蘇氨酸特異性蛋白激酶C家族的成員，涉及血管平滑肌收縮和血管內皮生長因子通路，參與鈣離子調控和血管平滑肌收縮[17]。分子對接進一步證實了網絡藥理學的成分篩選結果，結果表明潛在靶點PTGS2、MMP9、MMP1與槲皮素、木犀草素，PTGS2與山奈酚、β-胡蘿卜素、金合歡素等具有較好的結合活性，而且結合體構象穩定，表明這些可能為桑葉-菊花治療高血壓的關鍵成分和靶點。

對關鍵靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，進一步探究桑葉-菊花治療高血壓的作用機制。結果發現，桑葉-菊花可能通過參與脂多糖的反應、對平滑肌細胞增殖的正向調節、缺氧反應、氧化還原過程、蛋白質分解代謝過程的調控等生物學過程，在細胞外空間、內質網膜、細胞膜筏等部位，發生酶結合、絲氨酸內肽酶活性、蛋白質均聚活性、血紅素結合、蛋白質結合等分子反應，進而調控IL-17信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、TNF信號通路、癌癥中的微小核糖核酸信號通路等發揮降壓作用。TNF、IL-17信號通路與炎癥反應有關[18]，TNF信號通路異常調節會導致血管內皮細胞受損，平滑肌細胞增生，血管外周阻力增加而引起高血壓，IL-17信號通路可誘導多種組織和細胞中促炎細胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶的表達[19]。流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路主要與血液流變學有關，較低的血流剪切力易導致動脈硬化形成或斑塊破裂、內皮損傷，MMP-9、CRP水平升高，較高的血流剪切力有利于維持血管內皮的正常功能，保護血管內膜，防止高血壓的發生[20]。microRNAs(miRNAs)是內源性非編碼RNA小分子，主要在轉錄后水平調控基因表達，可以通過調控AT1R基因、鹽皮質激素受體基因的表達，抑制RAAS的功能，減少水鈉潴留，還可調控SRF、IRF、GAX等基因的表達，導致內皮功能紊亂，參與高血壓的發生發展[21]。同時，PTGS2、JUN、MMP1、MMP9、CXCL2等關鍵靶點也顯著富集在這些通路上，充分證明了桑葉-菊花具有多靶點、多通路協同增效的降壓作用。

綜上，本文采用網絡藥理學和分子對接的方法系統地分析了桑葉-菊花治療高血壓的分子作用機制，揭示了桑葉-菊花可能通過槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、花生四烯酸、金合歡素、木犀草素等潛在藥效成分，作用于JUN、MMP9、PTGS2、EGFR、CCND1、MMP1、PRKCA等多個靶點，通過IL-17信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、TNF信號通路和癌癥中的微小核糖核酸信號通路等，參與血管舒縮、鈣鈉離子轉運、血管內皮功能、炎癥反應、糖脂代謝和氧化應激等發揮降壓的作用，證明了桑葉-菊花治療高血壓具有多成分、多靶點、多通路協同作用的特點,為進一步探討其發揮作用的藥效物質基礎和作用機制研究提供方向，其后續尚需體內外實驗進一步證實其功效網絡的內在關聯和作用靶點。