烏頭堿抑制GSK-3β對抗β淀粉樣蛋白誘導的神經(jīng)細胞損傷

衛(wèi)智權，包傳紅，陳儀新，閻 莉

1廣西中醫(yī)藥大學 廣西中醫(yī)基礎研究重點實驗室；2廣西中醫(yī)藥大學 廣西中藥藥效研究重點實驗室；3廣西中醫(yī)藥大學壯醫(yī)藥學院，南寧 530200

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最主要的中樞神經(jīng)退行性疾病之一，以進行性認知功能障礙和行為損害為特征，伴隨社會老齡化程度的逐漸加深，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。國際阿爾茨海默病協(xié)會發(fā)布的世界阿爾茨海默病報告的數(shù)據(jù)顯示，全球共有約5 000萬AD患者，預計到2030年將達到8 200萬，到2050年將達1.52億。神經(jīng)組織β淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)異常增加不僅被認為是AD的主要病理變化之一，也是導致AD神經(jīng)細胞損傷的重要原因[2]。關于Aβ的神經(jīng)細胞毒性的研究證據(jù)不斷累積，然而，已經(jīng)完成的數(shù)個特異性清除Aβ的藥物臨床試驗均以失敗告終，使得藥物研發(fā)人員的注意力重新轉向增強神經(jīng)細胞對Aβ細胞毒作用的耐受能力，但是目前尚未有商品化的相應新藥推出[3]。

中醫(yī)藥治療AD具有較好的改善患者認知能力的效果。對于AD的病因病機的認識，中醫(yī)扶陽學派認為，“陰化太過，陽化不足，內生濁邪”是AD的主要病因病機，“元陽虛衰”、“陽虛陰實”在AD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了主導性的作用[4]。附子被譽為中藥“回陽救逆第一品”，具有顯著的補火助陽功效，為中醫(yī)扶陽學派廣泛用于AD的臨床治療，創(chuàng)制了五臟溫陽化瘀湯等一批臨床應用療效較好的復方制劑[5]。烏頭堿(aconitine)為附子的重要活性成分，既有的研究發(fā)現(xiàn)烏頭堿具有強心、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調節(jié)等藥理作用，其藥理作用機制與激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)有關[6-8]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是PI3K信號轉導途徑負調控的重要的下游靶激酶，Tyr216位點磷酸化的GSK-3β為其活化形式，Aβ誘導的GSK-3β過度活化被認為是AD進程中神經(jīng)細胞損傷的重要原因之一[9]。迄今為止，尚無證據(jù)表明烏頭堿能夠減輕Aβ介導的GSK-3β過磷酸化而導致的神經(jīng)細胞損傷。

本研究采用Aβ1-40體外誘導SH-SY5Y神經(jīng)細胞損傷的細胞模型，探討烏頭堿是否基于調控GSK-3β的Tyr216位點磷酸化水平而發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用，有助于在分子水平理解中藥附子用于AD臨床治療的分子機制。

圖1 烏頭堿的結構Fig.1 Structure of aconitine

1 材料

1.1 實驗細胞株

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞株，購自中國科學院昆明細胞庫。

1.2 主要試劑

烏頭堿(美國Sigma公司，批號16938)；Aβ1-40(美國Sigma公司，批號028M4864V)；DMEM高糖細胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號1896978)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司，批號1828728)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(美國Gibco公司，批號8117266)；Accutase膠原酶細胞解離液(美國eBioscience公司，批號E00023-1662)；CCK-8細胞增殖活性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所，批號DV652)。人乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)ELISA檢測試劑盒(武漢華美公司，批號H05016505)；AnnexinV-Alexa Fluor 488/PI 凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶公司，批號20181219)；組織細胞RIPA裂解液(北京索萊寶公司，批號20190903)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶公司，批號20190910)；蛋白電泳預制膠(北京索萊寶公司，批號20190923)。兔抗人GSK-3β單抗(美國Abcam公司，批號GR312697-8)；兔抗人GSK-3β(phospho Y216)單抗(美國Abcam公司，批號GR258576-24)；小鼠抗人GAPDH單抗(美國Abcam公司，批號GR202362-1)；HRP標記羊抗兔IgG抗體(上海生工公司，批號F902AA0024)；HRP標記羊抗小鼠IgG抗體(上海生工公司，批號E326AA0001)。

1.3 主要儀器

Mini-PROTEAN型垂直電泳儀和Mini Trans-blot型轉印儀(美國Bio-Rad公司)；ChemiDoc成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；5430R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Infinite 200 Pro酶標儀(瑞士Tecan公司)；LSR Fortessa多色分析流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

2 方法

2.1 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)

DMEM高糖培養(yǎng)基，含10% FBS、100 IU/mL的青霉素、100 mg/L的鏈霉素，初始細胞濃度2×105/mL，置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2，飽和濕度)進行培養(yǎng)。細胞長滿約70% 時進行傳代。

2.2 烏頭堿的細胞安全性測試與Aβ1-40誘導的SH-SY5Y細胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y神經(jīng)細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，初始細胞濃度1×105/mL。設置無藥物處理的正常對照組，以及每孔加入烏頭堿終濃度分別為1、2.5、5、10、20 nmol/L的烏頭堿各濃度處理組，各設置3個復孔。細胞培養(yǎng)箱孵育24 h，加入CCK8溶液10 μL，繼續(xù)孵育2 h。收集培養(yǎng)上清液，以酶標儀于450 nm處測定光吸收度。根據(jù)細胞安全性測試數(shù)據(jù)選擇后續(xù)實驗的烏頭堿安全濃度。

參考文獻報道的方法建立Aβ1-40誘導的SH-SY5Y細胞損傷模型[10]。取對數(shù)生長期的SH-SY5Y神經(jīng)細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，初始細胞濃度1×105/mL。設置正常對照組(normal)、Aβ1-40細胞損傷模型對照組(model)，后者加入終濃度20 μmol/L的Aβ1-40孵育24 h誘導細胞損傷。24 h后收集培養(yǎng)上清液，嚴格按照試劑盒說明書以ELISA檢測培養(yǎng)上清液LDH濃度，收集細胞以AnnexinV-Alexa Fluor 488/PI法流式細胞術分析細胞凋亡情況，評價建模方法的有效性。

2.3 烏頭堿干預Aβ1-40誘導的SH-SY5Y細胞損傷

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y神經(jīng)細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，初始細胞濃度1×105/mL。設置正常對照組(normal)、Aβ1-40細胞損傷模型對照組(model)、烏頭堿干預組(aconitine)，其中的烏頭堿干預組以終濃度5 nmol/L的烏頭堿預孵育12 h，其它兩組不作藥物干預。12 h后，Aβ1-40細胞損傷模型對照組與烏頭堿干預組加入終濃度20 μmol/L的Aβ1-40，誘導細胞損傷[11]。24 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測培養(yǎng)上清液LDH濃度；收集細胞，部分細胞用于AnnexinV-Alexa Fluor 488/PI法流式細胞術分析細胞凋亡情況，其余細胞用于蛋白免疫印跡檢測GSK-3β的磷酸化水平。

2.4 流式細胞術分析細胞凋亡與壞死

去除培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基，PBS洗3次，膠原酶細胞解離液消化10 min，加入適量4℃預冷的PBS，1 000 rpm離心5 min。小心去除上清，加入約1 mL 4 ℃預冷的PBS重懸細胞。取100 μL細胞懸液于5 mL 流式管中，加入Annexin V-Alexa Fluor 488溶液5 μL，混勻后于室溫避光孵育5 min；加入10 μL PI溶液，并加400 μL PBS，上機進行流式檢測。

2.5 Western blotting檢測細胞GSK-3β與Tyr216位點磷酸化GSK-3β

去除培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基，PBS洗3次，膠原酶細胞解離液消化10 min，加入適量4 ℃預冷的PBS，1 000 rpm離心5 min。小心去除上清，加入10倍體積裂解液4 ℃ 孵育20 min，12 000 rpm離心5 min，取上清，蛋白定量。準備蛋白電泳預制膠，蛋白上樣量20 μg。垂直電泳條件為恒壓100 V，指示劑泳動至凝膠中下部時停止。采用濕法轉膜，封閉，4 ℃搖床一抗孵育過夜，GSK-3β單抗、GSK-3β(phospho Y 216)單抗、GAPDH單抗稀釋倍數(shù)均為1∶1 200。一抗孵育結束，二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育60 min，ECL超敏化學發(fā)光液孵育3 min，即以ChemiDoc成像系統(tǒng)測定并計算目的蛋白與內參蛋白GAPDH條帶灰度的比值作為蛋白的相對表達水平。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)與形態(tài)觀察

細胞在DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS)生長速度稍慢，每5～7天可以1∶3傳代1次。細胞貼壁生長，具有一定程度聚集生長傾向。鏡下可見細胞呈不規(guī)則多邊形，具有數(shù)個明顯的尖細突起，部分細胞具有較長的類似神經(jīng)細胞樣突觸，如圖2。

圖2 SH-SY5Y細胞Fig.2 SH-SY5Y cell

3.2 烏頭堿對SH-SY5Y細胞的安全性測試

與未經(jīng)藥物處理的正常對照組比較，以終濃度為1、2.5、5 nmol/L的烏頭堿孵育SH-SY5Y細胞24 h，對于細胞的增殖活性無明顯影響；以終濃度為10、20 nmol/L的烏頭堿孵育SH-SY5Y細胞24 h，細胞增殖活性降低，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見圖3。

圖3 不同濃度烏頭堿的細胞安全性Fig.3 Cell safety of aconitine at different concentrations注：與正常對照組比較，*P<0.01。Note:Compared with normal control,*P<0.01.

3.3 Aβ1-40誘導的SH-SY5Y細胞損傷模型的建立

與正常對照組比較，模型對照組細胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平顯著提升，細胞凋亡率與細胞壞死率亦顯著增加，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見圖4。

圖4 Aβ1-40誘導的SH-SY5Y細胞損傷Fig.4 SH-SY5Y cell damage induced by Aβ1-40注：與正常對照組比較，*P<0.01。Note:Compared with normal control,*P<0.01.

3.4 烏頭堿對Aβ1-40誘導損傷的SH-SY5Y細胞培養(yǎng)上清液LDH水平、細胞凋亡與壞死的影響

與正常對照組比較，模型對照組細胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平顯著提升，細胞凋亡率與壞死率亦明顯增加，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。以5 nmol/L的烏頭堿預處理之后，與模型對照組比較，烏頭堿干預組細胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平顯著降低，細胞凋亡率與壞死率亦明顯下降，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見圖5A、B、D。

3.5 烏頭堿對Aβ1-40誘導損傷的SH-SY5Y細胞GSK-3β蛋白Tyr216位點磷酸化的影響

與正常對照組比較，模型對照組細胞GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著提升，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。以5 nmol/L的烏頭堿預處理之后，與模型對照組比較，烏頭堿干預組細胞GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著降低，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見圖5C、E。

圖5 烏頭堿減輕Aβ1-40誘導的SH-SY5Y細胞損傷Fig.5 Alleviation of aconitine on SH-SY5Y cell damage induced by Aβ1-40注：與正常對照組比較，*P<0.01。與模型對照組比較，△P<0.01。Note:Compared with normal control,*P<0.01.Compared with model control, △P<0.01.

4 討論

早在典型的認知功能障礙和行為損害等AD癥狀出現(xiàn)之前約15～20年，甚至更早的階段，對神經(jīng)細胞具有細胞毒作用的Aβ就已經(jīng)在AD患者大腦中發(fā)生了病理性聚集，然而此時并無明顯的記憶減退癥狀。Aβ對神經(jīng)細胞具有顯著的細胞毒性,不僅可以誘導細胞氧化應激與神經(jīng)炎癥，還能夠干擾細胞膜離子通道開放進而導致細胞內外離子濃度梯度失衡、細胞膜跨膜電位異常,并直接損傷膽堿能神經(jīng)傳導功能而導致膽堿能神經(jīng)信號傳遞障礙,以及直接誘導神經(jīng)細胞凋亡[12]。當患者表現(xiàn)出典型的認知與行為能力損害的時候，其大腦的神經(jīng)細胞已經(jīng)大量喪失，大腦影像檢查已經(jīng)可以觀察到明顯的腦萎縮，此時再使用藥物來清除Aβ，已經(jīng)很難獲得理想的臨床療效，這也是AD自于1907年被正式定義以來AD的臨床治療困難重重的原因之一[13]。尋找能夠增強神經(jīng)細胞對Aβ細胞毒作用的耐受能力的有效藥物，并在AD病理進程的早期階段進行藥物干預，是有效阻止AD持續(xù)進展的藥物治療綜合方案的重要內容之一。早期開始治療通常意味著患者需要持續(xù)時間漫長的藥物治療，必須謹慎權衡藥物治療的獲益與藥物安全性的風險?？紤]到中藥及其有效成分普遍具有較好的安全性，并且其多靶點藥效的特點契合AD這樣的復雜慢性疾病，早期開始中藥及其有效成分干預或許是合理的潛在選擇[14,15]。

中醫(yī)扶陽學派重用附子的溫陽化瘀治則，在AD的臨床治療中獲得了較好的認知與行為能力癥狀改善的療效[16,17]。烏頭堿既是附子的重要藥效物質，也是引起附子中毒的重要原因，因而附子遣方用藥的權衡較為復雜，也是選取烏頭堿作為研究對象的主導性原因。烏頭堿作為附子中的重要生物活性成分，既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其激活PI3K的藥理活性，而PI3K的激活能夠負調控Tyr216位點磷酸化導致的GSK-3β活化。GSK-3β參與Aβ的生成、聚集以及后續(xù)的神經(jīng)細胞損傷，而Aβ介導的神經(jīng)炎癥和氧化應激也可以誘導GSK-3β的磷酸化激活。此外，過度活化的GSK-3β亦可破壞重要的神經(jīng)遞質乙酰膽堿的活性，并加速神經(jīng)細胞軸突變性、阻礙軸突運輸，進一步加劇認知功能障礙?；谏鲜鲅芯堪l(fā)現(xiàn)，可以合理推測烏頭堿有助于增強神經(jīng)細胞抵抗Aβ的細胞毒作用，并且此有益的藥理作用與其抑制GSK-3β在Tyr216位點磷酸化而激活有關，然而該推測需要實驗證據(jù)加以證實。

在本研究中，以Aβ1-40孵育SH-SY5Y細胞成功建立細胞損傷模型，表現(xiàn)為細胞培養(yǎng)上清液的LDH水平上升，伴隨細胞凋亡與壞死率均顯著增加。5 nmol/L的烏頭堿并未表現(xiàn)明顯的細胞毒性，以其預處理SH-SY5Y細胞則可以顯著減輕Aβ1-40導致的細胞損傷，細胞損傷釋放的LDH顯著減少，細胞凋亡與壞死率均顯著降低，與此同時細胞的Tyr216位點GSK-3β磷酸化水平顯著降低，提示該濃度下烏頭堿的細胞安全性是可接受的，并增強細胞抵抗Aβ細胞毒作用的能力，而且此作用可能與其抑制GSK-3β在Tyr216位點的磷酸化而激活有關。

一般認為，烏頭堿具有心臟毒性，因此以凈水浸泡、膽巴炮制、反復蒸煮等方法減少附子中的烏頭堿，通過久煎的方法促進烏頭堿水解，然而仍然有微量的烏頭堿進入人體，并產生相應的藥理效應[18-20]。關于烏頭堿通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機制，有研究報道，一種質子偶聯(lián)的有機陽離子反向載體參與烏頭生物堿的血腦屏障運輸[21]。本研究的結果表明，即使在5 nmol/L的極低濃度水平，烏頭堿仍然可以發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用，顯著增強神經(jīng)細胞抵御Aβ的細胞毒性損傷，提示重用附子的溫陽化瘀中藥復方治療AD的藥效與烏頭堿增強神經(jīng)細胞抵抗Aβ的細胞毒作用密切相關。鑒于烏頭堿的固有心臟毒性，顯然需要設計嚴謹?shù)捏w內實驗研究，在不會造成心臟毒性的安全性前提下，驗證烏頭堿增強神經(jīng)細胞抵御Aβ的細胞毒性損傷的體內活性。