基于LF-NMR/MRI的丹參加工過程水分變化與色差相關性研究

劉沁榮，王一碩,2*，張振凌,2，石延榜,2，林竹一

1河南中醫藥大學；2河南省中藥生產一體化工程技術研究中心，鄭州 450046；3蘇州紐邁電子科技有限公司，蘇州 215000

低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)是利用氫原子在磁場中的自旋弛豫特性，通過橫向弛豫時間(transverse relaxation time，T2)的變化微觀解釋物料內部水分、油脂及蛋白質等物質的分布變化和遷移情況，具有快速、準確、無損的優點[1]。低場核磁共振技術是一種磁共振檢測方法，由核磁共振原理解釋水中含有大量氫原子，樣品中氫的橫向弛豫時間隨外界化學環境變化而不同，對應T2大小反映水分自由度的大小，T2越長表示水分結合度越小，流動性越強，常被用來表征樣品干燥/復水過程中水分遷移規律[2]。低場核磁共振技術能夠提供內部水分信息而不會對樣品造成干擾，現已廣泛應用于工業、食品領域，主要為觀察物料在干燥/浸潤過程中水分、油脂的存在形式變化，或通過測定水分比例進行摻假鑒別研究[3,4]。已有研究將低場核磁共振技術應用于中醫藥相關領域[5-8]，如在天麻干燥過程進行檢測，驗證該技術可以成為快速測定中藥材水分分析方法[9]；以不同品牌的黃明膠為檢測對象，利用低場核磁共振技術和主成分分析方法區別不同品牌的黃明膠[10]。

鮮藥采挖后經過干燥成中藥材，再根據用藥目的加工炮制成飲片，干燥指標與炮制工藝影響著飲片品質療效。總結歷版中國藥典及各省市地方炮制規范干燥指標設定限于“陰干、曬干”，具體參數尚未確定。已有研究表明干燥工藝條件、水分含量狀態對藥材的品質和外觀均有影響[11]，尤其是根莖類中藥材因質地堅硬，水分控制是加工炮制過程中重要質控指標。丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，始載于《神農本草經》列為上品，有“一味丹參飲，功同四物湯”之稱，在心血管疾病的防治上占據重要地位[12,13]。丹參種植成熟后經采收干燥形成藥材，干藥材經洗潤透切制成干燥飲片，具體流程示意見圖1。在傳統浸潤過程中需水進入藥材，浸潤不當易損失有效成分含量，不透徹則切制困難影響飲片外觀性狀。已有文獻表明[14,15]低場核磁共振技術可以為中藥材復水條件、終點判斷提供技術支持，為水分變化規律提供直觀參考依據，基于此借低場核磁共振技術研究丹參藥材浸潤過程中的水分變化規律。鑒于中藥材加工工藝繁瑣，整合開展中藥材產地加工與炮制一體化研究，已有學者進行丹參產地趁鮮切制可行性初探[16]，將丹參鮮藥材干燥至一定含水量后切制，所得切片外觀與傳統方法相近，活性成分含量高于傳統方法，認為丹參產地趁鮮切制是可行的。但是在該過程中水分控制模糊、狀態不直觀，不能科學合理界定終點指標，亟待采用科學技術進行深入解析。本實驗通過低場核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術監測丹參浸潤和干燥過程的水分變化，為深入規范產地加工規程提供技術方法和理論依據。

圖1 丹參生產加工示意圖Fig.1 Produciton processing methods of S.miltiorrhiza

中藥的色澤與中藥藥性、藥效密切相關，外觀色澤與中藥品質優劣存在重要的相關性。丹參傳統評價有“色紅者佳”、“皮丹肉紫”之說，說明其“皮”、“肉”的顏色特征尤為重要。有研究表明丹參外觀色澤與其所含丹參紅色素相關，丹參紅色素又稱總丹參酮，顏色與脂溶性成分存在正相關，表皮顏色深淺間接反映藥材品質差異[17]，故本研究借用精密色差分析技術，比較不同加工過程中丹參樣品的色差值，對水分規律和色差值進行相關性分析，為保障中藥材質量評價提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品采集河南省中藥生產一體化工程技術研究中心丹參種植基地，經河南中醫藥大學生藥學董誠明教授鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。

浸潤：取粗細一致、大小相同丹參藥材(約0.5～1.0 cm)平行3份，在0.5倍量水浸潤4次，達到藥材以潤透不傷水為度。分別取不同浸潤程度的藥材單根，快速進行T2和MRI成像檢測。另外將浸潤不同程度的丹參藥材切制2～4 mm，放置在HF8812型紅外干燥箱(電熱設備有限公司)50 ℃紅外干燥。

干燥：取粗細一致、大小相同鮮丹參根條(約0.5～1.0 cm)平行3份，于紅外干燥箱50 ℃干燥，在不同干燥點取樣切制2～4 mm飲片，放置室溫后進行稱量，并取單個丹參飲片進行T2測定及MRI成像檢測后并50 ℃紅外干燥。

1.2 低場核磁共振方法

采用MesoMR21-060H中尺寸核磁共振成像分析儀分析(蘇州紐邁電子科技有限公司，蘇州)，將樣品裝入中尺寸玻璃管放進永久磁場中心位置，磁體強度0.5 T，磁體溫度為32 ℃；利用硬脈沖自由感應衰減(free induction decay，FID)序列獲得樣品中心頻率，再利用脈沖序列(carr-purcell-meiboom-gill，CPMG)測樣品橫向弛豫時間，連續測量3次取平均值；CPMG序列設置參數為：SFO1(MHz)=21.239 643 MHz，P90(μs)=5.6，P180(μs)=12.8，SW(kHz)=250，TW(ms)=3 000，TE(ms)=0.2，RG1=10，DRG1=2，PRG=1，NECH=7 000，NS=32。

采用多脈沖回波序列CPMG掃描采集核磁信號，通過調整序列的選層梯度、相位編碼梯度和頻率編碼梯度，分別獲取樣品成像數據。利用sirt算法，迭代次數為10萬次進行反演得到T2加權成像譜圖；MRI加權成像列設置參數為：SFO1(MHz)=21.239 643 MHz，RFA90o=2.2，RFA180o=3.5，TR(ms)=1 200，TE(ms)=50，Slice width(mm)=3.0，Slices=1，Average=4，Read Size=256，Phase Size=192。

1.3 色差儀方法

采用HP-C220精密色差儀(上海圖新電子科技有限公司)，照明光源D65，狹縫寬度1 nm，視場選擇10°，以色空間L、a、b進行色澤量化。其中L表示明度，取值0～100數值為正，越接近0就越黑，值越大亮度越大；a、b有正負之分，其中紅色表示a正值，綠色表示a負值；b正值表示黃色，b負值表示藍色。

測定方法：取丹參樣品，打粉過篩(四號)，將藥材粉末平鋪在儀器測試處，測量其表面顏色，隨機掃描多次取平均值。

1.4 數據處理

利用LF-NMR系統軟件對數據進行采集，自動反演后系統進行結果曲線統計，得出弛豫時間T2與信號量幅值之間的關系；用SPSS、Origin軟件分析作圖。

2 結果與分析

2.1 FID信號量和水質量相關性分析

在LF-NMR檢測過程中，實體物質的弛豫時間在60 μs后的FID信號強度為自由水與結合水的總信號強度，根據低場核磁共振反演圖譜得出的信號量與標準品純水的質量進行相關性分析。為了驗證LF-NMR測量含水確性，將純水在與樣品同一測試條件參數下，進行擬合對比，所得擬合曲線見圖1。圖1中橫坐標是標準樣品對應水的質量，縱坐標是標準樣品的信號量，擬合后線性方程為y=1 678.6x+75.522，相關系數r2=0.999 6，呈顯著的線性關系，可采用LF-NMR技術測定丹參藥材在加工過程中水分含量變化。

圖2 低場核磁信號量與標準品相關性分析Fig.2 Correlation analysis between low field nuclear magnetic semaphore and standard

2.2 藥材浸潤過程中水分變化規律

在傳統丹參藥材炮制過程中，需將干燥丹參藥材根條進行浸潤復水軟化，至出現“彎折不斷”狀態，表示在此狀態下水分含量適中，可切制飲片作為臨床使用。通過觀察丹參藥材在不同浸潤時間的水分狀態與變化，進行弛豫譜圖和數據采取，得到結果表1和圖3。在圖3和表1中樣品中弛豫時間分布表明在該組織結構中存在多個水分群，通過計算弛豫時間T2對應的峰面積定量計算藥材中水份相對含量。

由表1可知丹參藥材浸潤前所含水份主要為結合水，浸潤開始弛豫峰逐漸右移形成兩個峰，自由水增加了50.64%，水分開始滲透藥材組織內部。隨著時間增加流動水增加至88.76%，且藥材內部明顯呈現出兩個水分峰，分別是結合水和自由水。圖3是丹參浸潤過程中水分遷移變化的弛豫譜圖，每個峰代表著1種類型的水分，峰面積表征該相態水的相對量大小，峰面積越大則該相態水含量越多。在圖3中橫坐標為弛豫時間，縱坐標為信號量振幅強度，根據浸潤時間不同，弛豫圖譜逐漸由一個吸收峰逐漸變成兩個吸收峰：在T21(0.01～10 ms)之間，對應流動性差的結合水；在T22(10～1 000 ms)之間，流動水浸入藥材內部，藥材組織發生變化；逐漸結合水和自由水的峰位置逐漸向右移動，自由水對應的信號幅值最大，說明丹參藥材內部水的自由程度在持續增加并形成規律性。

表1 丹參浸潤過程中弛豫時間和弛豫峰面積變化(n=3)Table 1 Relaxation time and peak area in the processing of S.miltiorrhiza (n=3)

圖3 丹參浸潤過程中T2 弛豫圖譜Fig.3 Relaxation spectrum of S.miltiorrhiza during processing

2.3 藥材浸潤過程中MRI圖像

利用MRI技術獲得的丹參藥材在浸潤過程中水分變化圖像見圖4。圖像中紅色代表的水分含量高，綠色代表水分含量較合適，由MRI圖像得出：丹參藥材浸潤過程中總體水分含量明顯增加，逐漸成像呈現浸潤漸濕的狀態；隨著浸潤時間加長，水分含量增加明顯并滲透內層；浸潤4.5 h時水分浸潤內部聚集并呈現擴散趨勢，此時丹參藥材呈現折不斷狀態，根據外觀指標與傳統經驗“彎曲法”基本相符；浸潤6 h后，藥材呈現兩頭水分充滿，斷面層呈黑褐色。

圖4 藥材浸潤過程中MRI圖像Fig.4 MRI image of S.miltiorrhiza during processing

2.4 鮮根干燥過程中水分變化規律

采挖后的丹參鮮根，若直接切制成飲片，極易出現飲片外觀性狀差、化學成分含量減少等問題。將丹參趁鮮切制待干燥至適當一定水分含量加工成飲片，既保證化學成分含量，又優化加工工藝，省時快捷。在丹參鮮根樣品干燥過程中，橫向弛豫時間T2的大小反映不同狀態的水分分布與變化情況，T2越小水分自由度越小，水與所處環境中的大分子結合越緊密；T2越大表明水分自由度越大越容易除去。丹參鮮根在干燥過程中水分狀態和變化的弛豫時間和峰面積見表2，從表2可知隨著干燥時間的延長水分峰向左移動，水分的流動性變差，峰面積逐漸變小。干燥初始時，丹參鮮根樣品中含結合水約2.26%，流動水約97.74%；隨著干燥時間的延長，流動水峰面積逐漸下降，結合水峰面積逐漸升高，說明丹參鮮根樣品中流動水向結合水方向轉化；干燥12 h后水分狀態大部分轉化為結合水。

表2 丹參鮮根干燥過程中弛豫時間和弛豫峰面積變化Table 2 The time and peak area of fresh root of S.miltiorrhiza were changed during processing

丹參鮮根在干燥過程中水分狀態和變化的弛豫圖譜變化見圖5。從圖5可知不同時間段測得的T2弛豫圖譜均有2個較為明顯的吸收峰：在T21(0.01～10 ms)范圍內，呈現丹參鮮根中結合水分布狀況；在T22(10～1 000 ms)范圍內，呈現丹參鮮根中自由水分布狀況。結果表明隨著干燥時間的延長，丹參鮮根內部水分分布發生變化。

圖5 丹參鮮根干燥過程中T2 弛豫圖譜Fig.5 Relaxation spectrum of fresh root of S.miltiorrhiza during processing

2.5 鮮丹參干燥過程中MRI圖像變化

利用MRI技術獲得的丹參鮮根干燥過程中圖像變化(見圖6)，其中紅色代表的水分含量高，黃色代表水分含量低，綠色代表水分含量減少。MRI圖像表明丹參鮮根干燥過程水分含量由內向外減少，12 h時丹參飲片成像逐漸邊模糊，此時中藥材組織被破壞說明內部水分含量和狀態發生缺省變化，內部自由水消失剩下少量結合水；隨著干燥時間延長24 h后水分集中內層且內部組織被破壞，達到干燥臨界點，且水分含量太低成像模糊。

圖6 丹參鮮根干燥過程中MRI圖像Fig.6 MRI image of fresh root of S.miltiorrhiza during processing

2.6 色差技術評價丹參藥材質量

2.6.1 浸潤前后色度值測定

利用色差儀以傳統方法所得丹參為參比，借用色差值對不同浸潤時間的丹參進行客觀顏色分級。根據色差技術結果顯示隨著浸潤時間延長(見表3)，丹參表皮顏色變深，由磚紅色逐漸變成棕紅色，根據色差儀檢測結果顯示隨著浸潤時間延長a值持續升高，其丹參外表皮顏色越紅，當浸潤至4.5 h后顏色與傳統表皮顏色相符。

表3 丹參藥材浸潤品L*、a*、b*均值(n=10)Table 3 Mean value of L*,a* and b* of infiltration product(n=10)

運用分析軟件對浸潤品弛豫峰面積與色度值進行相關性分析，結果表明不同丹參浸潤品的水分狀態與色度值呈一定相關性。在此相關性中結合水與色差a值呈顯著負相關，相關系數-0.723；流動水與L值和a值呈正相關，相關系數分別為0.635和0.986。同時不同狀態水分之間呈現相關關系，結合水與自由水呈對立關系(見表4)。

表4 弛豫峰面積與色度值的相關性分析Table 4 Correlation analysis of relaxation peak area and chromaticity value

2.6.2 鮮丹參干燥前后色度值測定

根據色差儀規定，L正值表示偏白，a正值表示偏紅，b正值表示偏黃，數值越大顏色越深。在鮮丹參干燥過程中，隨著干燥時間延長a、b值逐漸減少，這與實驗中鮮丹參表皮顏色逐漸變淺結果相符，見表5。

表5 鮮根干燥品L*、a*、b*均值(n=10)Table 5 Mean value of L*,a* and b* of fresh root products(n=10)

運用分析軟件對丹參鮮根不同干燥時間時的弛豫峰面積與色度值進行相關性分析，結果表明在不同干燥品水分狀態與色度值呈一定相關性，見表6。流動水與a值和b值呈正相關，相關系數分別為0.757和0.686；但是與L值呈極顯著負相關。

表6 弛豫峰面積和色度值的相關性分析Table 6 Correlation analysis of relaxation peak area and chromaticity value

3 討論

本實驗以水質量和低場核磁信號量進行定標，擬合后水質量與信號量吸收峰面積呈顯著的線性關系，r2值為0.999 6，表示該法可靠。本研究通過低場核磁共振技術研究丹參在不同加工過程中的水分含量與變化規律，由T2弛豫圖譜顯示在不同狀態下出現兩個峰，初步說明丹參內部水分狀態分為兩種：結合水和流動水；隨加工方法不同水分所對應信號幅值發生變化，吸收峰呈現不同方向的遷移。丹參藥材在浸潤6 h后，外界水開始滲透藥材內部，自由水與結合水開始匯合轉化，最后水分含量增加至88.76%；隨著水分含量變化，藥材外觀形狀、表皮顏色皆發生變化，且易切制；鮮丹參藥材在50 ℃恒溫干燥12 h后，自由水含量下降至46.69%，約24 h后接近干燥終點，此時組織內部中剩余少量結合水，MRI圖像已不能辨識。有研究表明不同干燥方法下丹參脫水率與各成分含量呈負相關[18]，這也表示含水量控制對干燥具有較大的影響。丹參傳統加工過程繁瑣，已有學者對丹參趁鮮切制工藝優化進行研究認為趁鮮切制是可行的，但具體藥材含水量及工藝參數尚未完善[16]。本研究表明低場核磁共振技術，可以快速檢測出丹參干燥或浸潤過程中內部水分變化規律，也為藥材干燥/浸潤的終點控制進行科學評判。

中藥色澤是中藥質量的重要指標之一，自古以來人們就依靠實踐經驗總結出根據顏色鑒別中藥真偽優劣的方法，即所謂“辨色論質”。丹參“皮丹肉紫”，因主要含有紅色菲醌類衍生物，藥材表現出強烈的紅色色澤。在丹參藥材浸潤過程中，色差a值隨著時間延長逐漸升高，藥材外表皮顏色逐漸加深，并且結合水與a值呈顯著負相關，表示水分含量與脂溶性丹參酮類成分存在一定關系。在丹參鮮根干燥過程中，隨著時間延長a、b值逐漸減少，表皮顏色隨之逐漸變淺，當干燥24 h時a值劇烈減少，流動水比例與a值和b值呈顯著正相關，與L值呈極顯著負相關，反映在此狀態下丹參酮類成分劇烈減少。水溶性成分丹酚酸B是鮮丹參采收干燥后的產物，但隨著時間延長含量逐漸減少[19]，作為水溶性成分這一變化極可能與樣品含水量有關，是否能通過低場核磁共振檢測藥材水分臨界點從而控制化學成分含量，這對中藥材質量控制有參考意義。

植物根據分子狀態及環境影響，內部可分為兩種狀態水：結合水和自由水，結合水被植物細胞中大分子吸附，不能隨意自由流動；自由水存在于植物細胞間隙，能夠自由移動或消失。根系是中藥從生長環境中獲取養分的重要部位，由于根內部結構復雜且非均勻，在水分分布和控制方面較為困難。植物根莖富含大量水分，而氫在水分中豐度極高，低場核磁共振譜圖中對氫原子有較強的信號值，這也成為低場核磁可廣泛應用研究根莖類藥材水分規律的特色。低場核磁作為新興研究方法，與常規傳統分析方法相比，具有結果直觀、數據準確、檢測快捷等優點，在水分測定研究中顯示出獨特的優越性。本研究以根莖類藥材丹參為研究對象，闡述丹參浸潤和干燥過程中水分變化規律，為根類藥材加工提供了更為直觀的評價方法，也為研究炮制加工過程中水分變化提供一種快速無損可視化的技術手段，同時在中藥水分控制、加工工藝優化方面提供科學依據。不足之處未能結合化學成分含量進行綜合分析，后期會結合活性成分變化，就炮制加工過程中藥材水分與化學成分的差異規律進行科學系統闡述，為中藥研究與應用提供新思路。